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Aug 06, 2023

Mejora de la tolerancia a la sequía de mutantes de alfalfa (Medicago sativa L.) mutagenizados por EMS mediante cribado in vitro en la etapa de germinación

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12693 (2022) Citar este artículo

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Los objetivos de este estudio fueron determinar los genotipos mutantes novedosos de alfalfa (Medicago sativa L.) tolerantes a la sequía mediante el cribado de semillas 340675 M3 mutagenizadas por EMS en las etapas de germinación en presencia de estrés osmótico del 35 % de PEG6000. El ensayo de crecimiento de la raíz proporcionó varios mutantes candidatos tolerantes a la sequía. De ellos, 4 mutantes se evaluaron adicionalmente en condiciones de déficit de agua aplicadas durante 24 días después del primer corte en la etapa de brote de floración. Los resultados revelaron que los mutantes determinados como tolerantes a la sequía en la etapa de germinación también eran tolerantes a las condiciones de déficit hídrico. Se encontró que el contenido de proteína y los valores de superóxido dismutasa eran más altos en todos los mutantes que en los controles. Los valores de peróxidos de ascorbato, glotón reductasa y peroxidasa lipídica variaron según el genotipo mutante y la duración del estrés por sequía. El estrés por sequía cambió significativamente los niveles transcripcionales de los genes MtP5CS, MtDehyd, MseIF-2, MtRD2 y MsNAC. Estos resultados indicaron que el cribado in vitro de semillas mutantes de alfalfa para la tolerancia osmática en la germinación y las primeras etapas de crecimiento de las plántulas pudo determinar con éxito los mutantes de alfalfa tolerantes a la sequía que también eran tolerantes a las condiciones de déficit de agua después del primer corte en la etapa de yema floral.

El calentamiento global amenaza la producción agrícola actual al limitar el agua de riego necesaria para la producción vegetal1. Por lo tanto, el desarrollo de nuevas variedades de plantas que puedan tolerar mejor las condiciones de estrés por sequía y minimizar las pérdidas de rendimiento tiene una importancia estratégica en términos de garantizar la seguridad alimentaria de las generaciones futuras. Sin embargo, la compleja estructura del mecanismo de estrés por sequía es una de las razones más importantes del lento progreso de los estudios de mejoramiento2. La tolerancia a la sequía muestra una herencia cuantitativa controlada por varios genes3. Las relaciones epistáticas y pleiotrópicas entre estos genes también hacen que sea extremadamente difícil ponerlos en práctica para estudios de reproducción3. Además, factores como los períodos de desarrollo de una planta, la duración y la gravedad del estrés también son determinantes importantes para evaluar el alcance de la herencia cuantitativa del estrés por sequía4.

Las plantas tolerantes a la sequía tienen la capacidad de realizar sus funciones normales incluso en condiciones de bajo potencial hídrico5. Las plantas utilizan varias estrategias en condiciones de déficit de agua para minimizar los efectos nocivos del estrés por sequía a nivel fisiológico, morfológico y transcripcional. Las plantas también utilizan una estrategia de escape que se define como la capacidad de las plantas para mantener un alto potencial hídrico en condiciones de sequía. Esta estrategia generalmente es provista por algunos cambios agromorfológicos en las plantas, como la reducción del área foliar, la reducción del número y la conductividad de los estomas, la formación de sistemas radiculares densos y el aumento de la relación raíz/tallo6.

La alfalfa (Medicago sativa L.) es un cultivo forrajero esencial y tiene una importancia económica significativa en todo el mundo debido a su invaluable contribución a la agricultura y la ganadería sostenibles de diversas maneras7, incluido el alto rendimiento del heno, la excelente calidad nutricional y la capacidad de fijación de nitrógeno8. Las variedades cultivadas dentro de las especies de alfalfa son autotetraploides con genomas casi idénticos9. La alfalfa generalmente se muestra tolerante a la sequía debido a su sistema de raíces profundas que generalmente se manifiesta en los pocos años posteriores a la siembra10. Sin embargo, junto con la germinación y el crecimiento temprano de las plántulas, la etapa de rebrote de la alfalfa justo después del corte en el año de siembra es muy vulnerable al estrés por sequía. Además, la alfalfa necesita mucha más agua de riego en comparación con otras plantas cultivadas, especialmente en zonas áridas, ya que se cosecha varias veces y proporciona el forraje de mayor rendimiento en una temporada de crecimiento.

Aunque se ha logrado un éxito parcial en el desarrollo de nuevas variedades de alfalfa que toleran varios tipos de estrés abiótico, incluida la sequía11, se han logrado avances muy limitados en comparación con otras especies de cultivos importantes12. Además, la identificación de plantas tolerantes al estrés por sequía mediante selección directa depende principalmente tanto de la variación genética del material utilizado como del éxito de los métodos de selección. Parece ser muy difícil desarrollar nuevos genotipos de alfalfa tolerantes a la sequía mediante el uso de métodos de cruzamiento y mediante la selección de una base genética de alfalfa existente limitada13. Por lo tanto, hemos utilizado la mutagénesis de etil metano sulfonato (EMS) para crear una nueva variación genética. El cribado de semillas mutantes M3 en la etapa de germinación en condiciones in vitro proporcionó varios candidatos tolerantes a la sequía. Cuatro de ellos también fueron reevaluados a nivel fisiológico, morfológico y transcripcional en condiciones de déficit hídrico aplicadas durante 24 días después del primer corte en la etapa de botón floral, que también se consideró como otra etapa crítica para determinar el rendimiento de rebrote de la alfalfa en ambas condiciones. condiciones de crecimiento con riego y sin riego. Las respuestas al estrés por sequía de los mutantes se compararon con plantas de control irrigadas y no irrigadas.

El cribado de semillas 340675 M3 en las etapas de germinación y crecimiento temprano de plántulas en presencia de estrés osmótico de PEG6000 al 35 % dio como resultado varios candidatos tolerantes a la sequía (Fig. 1). De ellos, 4 mutantes se probaron más para determinar el rendimiento de rebrote en condiciones de déficit de agua aplicadas durante 24 días después del primer corte en la etapa de yema de floración y los resultados se compararon con plantas de control con riego (Z1) y sin riego (Z2) (Tabla 1 ).

Detección de semillas M3 mutantes y plántulas desarrolladas. (A) Vista cercana de las semillas plantadas en los medios MS sin procesar que contienen 35 % de PEG6000. (B) *, semillas de control no mutadas; **, semillas M3 mutantes. (C–D) Plántulas mutantes candidatas de la selección. Las flechas muestran alargamientos radiculares. (E–F) Plántulas rescatadas de medios MS y plantadas en violas. (G–H) Plántulas plantadas en macetas de plástico y plantas desarrolladas en la etapa de brote de floración.

Los resultados de los parámetros agromorfológicos revelaron variaciones importantes no solo dentro de los mutantes M3, sino que también mostraron diferencias significativas con respecto a las plantas testigo (Cuadro 1). La altura de la planta de los mutantes en el día 18 de sequía osciló entre 36,3 cm y 45,7 cm, mientras que los controles Z1 y Z2 tenían una altura de planta de 42,1 cm y 38 cm, respectivamente (Cuadro 1). Cuando el estrés por sequía se extendió a 24 días, todos los mutantes con una excepción (mutante Y20) dieron una altura de planta más larga que el control Z2 (52,0 cm). El tallo principal generalmente se ha engrosado a medida que el estrés por sequía se extendió del día 18 al 24, con excepción del mutante Y20 y el control Z2 (Tabla 1). Los efectos del estrés por sequía en la altura natural de las plantas de los mutantes variaron según la duración de la sequía. El número de ramas laterales varió de 2 a 9 y de 4 a 11 por planta en los días 18 y 24 de estrés por sequía, respectivamente. Excepto el mutante Y20, la duración del estrés por sequía aumentó el número de ramas laterales en todos los mutantes, así como en las plantas de control (Cuadro 1). El número de hojas por planta aumentó en los controles y la planta mutante X6, mientras que se determinó una disminución en el número de hojas por planta en los mutantes Y20, Y25 e Y35 cuando el estrés por sequía se extendió de 18 a 24 días (Cuadro 1). El estrés por sequía redujo la longitud y el ancho del folíolo medio en todos los mutantes y los controles en los días 18 y 24 de estrés por sequía (Cuadro 1). Sin embargo, la tasa de reducción fue menor en los mutantes que en la planta de control Z2 (Tabla 1). Se encontró que las temperaturas del dosel de la planta eran significativamente diferentes entre los controles y los mutantes en los días 18 y 24 de estrés por sequía (Tabla 1). Los mutantes Y20 e Y30 tuvieron menos temperatura en el dosel que ambos controles en el día 18 de estrés por sequía, mientras que la temperatura del dosel fue significativamente más baja en el mutante Y20 que en los otros mutantes en el día 24 de estrés por sequía (Tabla 1). El mayor número de semillas por vaina (2 semillas/vaina) y el mayor rendimiento de semillas por planta (1,34 g/planta) se obtuvieron del mutante X6, mientras que el mutante Y35 no dio ninguna semilla (Cuadro 1). El color de las flores de los mutantes varió de rosa a púrpura, mientras que los controles solo tenían color rosa (Tabla 1).

El estrés por sequía redujo significativamente el contenido de proteínas de la alfalfa (p < 0,001) (Fig. 2A). Sin embargo, se encontró que el contenido total de proteína en los mutantes Y20 e Y30 era más alto que en las plantas de ambos controles (Z1 y Z2), mientras que los mutantes X6 e Y35 tenían el mismo nivel de contenido de proteína con el control irrigado (Z1) (Fig. 2B). Dentro de los mutantes, el mutante Y20 dio el mayor contenido total de proteína (100,68 mg/ml) mientras que el mutante Y35 tuvo el más bajo (66,04 mg/ml) considerando todos los intervalos de tiempo (Fig. 2B). Los niveles de proteína del mutante Y20 aumentaron significativamente a medida que se prolongaba el estrés por sequía, mientras que se mantuvo estable en el mutante Y30 en todos los intervalos de tiempo evaluados (Fig. 2C). Los niveles de proteína más altos (104,9 mg/ml y 118,60 mg/ml) se obtuvieron del mutante Y20 mientras que el control Z2 tuvo 25,30 mg/ml y 35,75 mg/ml en los días 18 y 24 de estrés por sequía, respectivamente (Fig. 2C). ).

Contenidos de proteínas. (A) Efectos generales del estrés por sequía en las plantas mutantes y de control en intervalos de tiempo determinados, n = 18. (B) Contenido total de proteínas de las plantas mutantes y de control, n = 9. (C) Efectos del estrés por sequía en el contenido de proteínas de las mutantes y plantas de control en intervalos de tiempo dados, las barras de error indican desviación estándar, n = 3. Letras diferentes indican diferencias significativas en P < 0,05. Las letras mayúsculas, minúsculas o cursivas minúsculas indican análisis estadísticos realizados en intervalos de tiempo determinados.

El estrés por sequía disminuyó significativamente los niveles de isoenzima SOD (Fig. 3A) y el mutante Y35 tuvo el nivel más alto de SOD (1,54 U/mg de proteína) (Fig. 3B). Dieciocho días de estrés por sequía aumentaron significativamente los niveles de SOD tanto en los controles como en las plantas mutantes X6, aunque los niveles de SOD disminuyeron significativamente a un nivel observado antes de la etapa de corte en los otros mutantes (Fig. 3C). En contraste con los controles y el mutante X6, los niveles de la enzima SOD se elevaron significativamente el día 24 del estrés por sequía en los mutantes (Fig. 3C).

Niveles de la isoenzima superóxido dismutasa (SOD). (A) Efectos generales del estrés por sequía en plantas mutantes y de control en intervalos de tiempo determinados, n = 18. (B) Niveles generales de SOD de plantas mutantes y de control, n = 9. (C) Efectos del estrés por sequía en los niveles de SOD de plantas mutantes y plantas de control en intervalos de tiempo dados, las barras de error indican desviación estándar, n = 3. Letras diferentes indican diferencias significativas en P < 0,05. Las letras mayúsculas, minúsculas o cursivas minúsculas indican análisis estadísticos realizados en intervalos de tiempo determinados.

El primer período de estrés por sequía (18 días) disminuyó los niveles de TBARS (Fig. 4A), mientras que no se detectaron diferencias significativas entre los períodos de tiempo antes del corte y el día 24 de estrés por sequía (Fig. 4A). Los niveles más altos de TBARS (3,80 y 3,36 nmol/g de proteína) se obtuvieron de los mutantes Y20 y X6, respectivamente, mientras que el mutante Y35 tenía los más bajos (1,83 nmol/g de proteína) (Fig. 4B). El mutante Y35 aumentó el nivel de TBARS a medida que el estrés por sequía se extendió de 18 a 24 días, mientras que el mutante Y30 lo disminuyó (Fig. 4C). En general, se detectó un patrón similar de niveles de TBARS en los controles y mutantes Y20 y X6 en intervalos de tiempo dados de estrés por sequía en comparación con los niveles de TBARS antes de la etapa de corte (Fig. 4C).

Niveles de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS). (A) Efectos generales del estrés por sequía en plantas mutantes y de control en intervalos de tiempo determinados, n = 18. (B) Niveles generales de TBARS de plantas mutantes y de control, n = 9. (C) Efectos del estrés por sequía en los niveles de TBARS de plantas mutantes y plantas de control en intervalos de tiempo dados, las barras de error indican desviación estándar, n = 3. Letras diferentes indican diferencias significativas en P < 0,05. Las letras mayúsculas, minúsculas o cursivas minúsculas indican análisis estadísticos realizados en intervalos de tiempo determinados.

La actividad enzimática APX más alta (0,17 U/mg de proteína) se determinó el día 18 de estrés por sequía en comparación con los otros intervalos de tiempo probados (Fig. 5A). La actividad de APX fue la más alta (0,19 U/mg de proteína) en el control Z2, mientras que no se detectaron diferencias significativas entre el mutante Y35 (0,148 U/mg de proteína) y el control Z1 (0,130 U/mg de proteína) considerados períodos de tiempo generales ( Figura 5B). El mutante Y35 tenía el nivel general de APX más alto en comparación con los otros mutantes (Fig. 5B). La actividad de APX fue la más alta en el mutante Y35, mientras que ambos controles tenían la actividad de APX más baja en el momento anterior al corte (Fig. 5C). La actividad de la enzima APX aumentó significativamente el día 18 de estrés por sequía en los controles y el mutante X6 en comparación con los niveles determinados antes del corte, mientras que estadísticamente se determinaron los mismos niveles de actividad de la enzima APX en el control irrigado (Z1) y los mutantes el día 18 de estrés por sequía (Fig. 5C). Excepto en el mutante Y35, se determinaron niveles reducidos de actividad de la enzima APX en las plantas de control y mutantes en el día 24 de estrés por sequía en comparación con el día 18 de estrés por sequía, aunque el mutante Y35 tenía el mismo nivel de actividad de la enzima APX con ambos controles (Fig. .5C).

Actividad de la enzima ascorbato peroxidasa (APX). (A) Efectos generales del estrés por sequía en plantas mutantes y de control en intervalos de tiempo determinados, n = 18. (B) Niveles generales de APX de plantas mutantes y de control, n = 9. (C) Efectos del estrés por sequía en los niveles de APX de plantas mutantes y plantas de control en intervalos de tiempo dados, las barras de error indican desviación estándar, n = 3. Letras diferentes indican diferencias significativas en P < 0,05. Las letras mayúsculas, minúsculas o cursivas minúsculas indican análisis estadísticos realizados en intervalos de tiempo determinados.

Los niveles de GR aumentaron significativamente durante el estrés por sequía en comparación con antes del corte (Fig. 6A). Aunque se observó una disminución significativa al final del estrés por sequía, el nivel general de GR fue significativamente mayor que antes de la etapa de corte (Fig. 6A). El nivel de GR general más alto (0,098 (U/mg de proteína) se obtuvo del control Z2, mientras que no se determinaron diferencias significativas en los mutantes y el control Z1 (Fig. 6B). Se determinaron diferencias significativas en los niveles de GR de los controles y las plantas mutantes. para todos los períodos de tiempo dados (Fig. 6C).El control irrigado (Z1) dio el nivel de GR más bajo en la etapa anterior al corte, mientras que estadísticamente se determinaron los mismos niveles de GR en el control Z2 y mutantes (Fig. 6C). el estrés por sequía aumentó significativamente los niveles de GR tanto en las plantas de control como en las mutantes, excepto en el mutante Y35, aunque la cantidad de GR fue relativamente menor en los mutantes que en las plantas de control (Fig. 6C). Excepto el mutante X6, los mutantes mostraron un mayor nivel de GR el día 24. día de estrés por sequía, mientras que se determinó un contenido de GR reducido en los controles en comparación con el día 18 de estrés por sequía (Fig. 6C).Se determinó un patrón similar de contenido de GR en el mutante X6 y las plantas de control en períodos de tiempo determinados (Fig. 6C).

Actividad de la enzima glutatión reductasa (GR). (A) Efectos generales del estrés por sequía en plantas mutantes y de control en intervalos de tiempo dados, n = 18. (B) Niveles generales de GR de plantas mutantes y de control, n = 9. (C) Efectos del estrés por sequía en los niveles de GR de plantas mutantes y plantas de control en intervalos de tiempo dados, las barras de error indican desviación estándar, n = 3. Letras diferentes indican diferencias significativas en P < 0,05. Las letras mayúsculas, minúsculas o cursivas minúsculas indican análisis estadísticos realizados en intervalos de tiempo determinados.

La expresión del gen MtP5CS mostró una gran variación, con aumentos de 0,31 veces (X6) a 4,71 veces (Y30) en el día 18 de estrés por sequía, aunque los niveles de expresión disminuyeron a 0,03 (mutante Y30) y 1,14 veces (X6) en el día 18. Día 24 de estrés por sequía (Fig. 7A). Por otro lado, los niveles de expresión del gen MtP5CS disminuyeron en el control Z2 de 18,6 veces a 0,9 veces cuando el estrés por sequía se extendió de 18 a 24 días, mientras que el control Z1 aumentó el nivel de expresión del mismo gen de 3,49 veces a 0,9 veces. 21,75 veces en los mismos intervalos de tiempo (Fig. 7A). Excepto en el mutante X6, se observaron patrones de expresión similares en los mutantes en respuesta al estrés por sequía, mientras que el control Z1 mostró una expresión del gen MtP5CS elevada a medida que el estrés por sequía dura de 18 a 24 días (Fig. 7A).

Niveles de expresión relativos de genes sensibles a la sequía en intervalos de tiempo determinados (A–E) Cambios en la expresión de MtP5CS (Medicago truncatula pyrroline-5-carboxylate synthetase) (A), MtDehyd (Medicago truncatula dehydrin) (B), MseIF-2 (Medicago factor de iniciación de la traducción eucariota sativa 2) (C), genes MtRD2 (Medicago truncatula Respuesta a la desecación 2) (D) y MsNAC (Medicago sativa NAC; NAM, ATAF y CUC2) (E) en tejidos foliares de plantas mutantes de alfalfa. Se usó rRNA Ms18s (RNA ribosómico 18S) como gen de referencia. Los resultados que se muestran son medias ± error estándar, n = 3. Letras diferentes indican diferencias significativas en P < 0,05.

La regulación de MtDehyd, también conocida como gen LEA (embriogénesis abundante tardía), mostró grandes cambios en respuesta al estrés por sequía aplicado después del primer corte en la etapa de yema y se encontró que los niveles de regulación del gen relacionado dependían del genotipo (Fig. 7B) . Las expresiones del gen MtDehyd en el día 18 de estrés por sequía variaron de 0,07 veces (X6) a 3,12 veces (Y20) en comparación con el gen de referencia (Fig. 7B). La expresión del gen MtDehyd disminuyó significativamente en las plantas mutantes X6, Y35 y control Z2 en el día 18 de estrés por sequía, mientras que se observaron mayores niveles de expresión del mismo gen en las plantas mutantes Y20, Y230 y control Z1 en los mismos intervalos de tiempo en comparación con antes de la etapa de corte (Fig. 7B). La expresión del gen MtDehyd aumentó en el control Z1 (de 2,42 a 39,23 veces) y en el mutante X6 (de 0,07 a 0,45 veces) cuando el estrés por sequía se extendió de 18 a 24 días (Fig. 7B).

La regulación de la expresión del gen MseIF-2 varió según el genotipo mutante y la duración del estrés por sequía (Fig. 7C). Por ejemplo, los mutantes Y20, Y30 e Y35 mostraron un aumento de 1,26, 1,97 y 1,71 veces en el día 18 de estrés por sequía, mientras que disminuyó significativamente a cambios de 0,38, 0,04 y 0,25 veces en el día 24 de estrés por sequía, respectivamente (Fig. 7C). Por otro lado, la expresión del gen MseIF-2 del mutante X6 disminuyó el día 18 de estrés por sequía y luego aumentó el día 24 de estrés por sequía en comparación con antes del corte (Fig. 7C). Los niveles de expresión del gen MseIF-2 se elevaron significativamente en ambas plantas de control (Z1 y Z2) a medida que el estrés por sequía se extendió de 18 a 24 días, mientras que se observaron disminuciones significativas en los mutantes con la excepción del mutante X6 (Fig. 7C).

Extender la duración del estrés por sequía de 18 a 24 días provocó una disminución significativa en los niveles de expresión del gen MtRD2 en los mutantes Y20, Y30 e Y35, mientras que provocó aumentos significativos en ambas plantas de control (Z1 y Z2) (Fig. 7D). La expresión del gen MtRD2 más alta (5,25 veces) y más baja (0,09 veces) se determinó en el mutante Y30 considerado los días 18 y 24 de estrés por sequía, respectivamente (Fig. 7D).

La expresión del gen MsNAC mostró una gran variabilidad y la magnitud ha cambiado en función del tiempo y la duración del estrés por sequía en las plantas de control y mutantes (Fig. 7E). Por ejemplo, no hubo una diferencia significativa en la planta de control Z1 en el día 18 de estrés por sequía, mientras que se determinó un aumento de 16,01 veces en la planta de control Z2 en el mismo intervalo de tiempo (Fig. 7E). La expresión del gen MsNAC mostró una disminución significativa en los mutantes X6 (100,4 veces), Y20 (0,63 veces) e Y35 (0,55 veces) aunque el mutante Y30 mostró un aumento de 1,44 veces en el día 18 de estrés por sequía (Fig. .7E). Se determinó un gran aumento en la expresión del gen MsNAC (177,32 veces) en la planta de control irrigada (Z1), mientras que se observó una gran disminución (disminución de 100,70 veces) en el mutante Y30 en el día 24 de estrés por sequía en comparación con el gen de referencia. (Figura 7E).

El estrés por sequía puede causar una pérdida significativa de rendimiento y la magnitud puede variar dependiendo no solo de su intensidad y severidad, sino también de las etapas de desarrollo de la planta14. Al igual que en muchas otras especies de cultivos importantes, la etapa de germinación de la semilla de la alfalfa es muy vulnerable al estrés por sequía15. Por lo tanto, se necesitan nuevos cultivares de alfalfa que toleren mejor el estrés por sequía en la etapa de germinación para minimizar y asegurar la estabilidad de la producción de alfalfa. Informes anteriores indicaron que las sustancias osmóticas con alto peso molecular, como el PEG, son uno de los enfoques más populares para la detección de genotipos objetivo en la germinación u otras etapas de desarrollo de muchas plantas, incluida la alfalfa16. También se informó una correlación positiva entre la germinación en medios suplementados con PEG y el comportamiento de toda la planta en condiciones de déficit de agua en el campo17. Sin embargo, los métodos de detección de laboratorio que simulan la deficiencia de agua y las condiciones de estrés por sequía deberían ser confiables para determinar los genotipos deseables de los programas de mejoramiento exitosos18. El cribado de semillas 340675 M3 en presencia de medio suplementado con 35 % de PEG600 en condiciones de germinación in vitro arrojó varios candidatos tolerantes a la sequía que mostraron un crecimiento radicular visible y medible mientras que no se observó germinación en las semillas de control bajo las mismas condiciones de estrés, lo que indica que la raíz El ensayo de crecimiento y las condiciones de germinación utilizadas en el estudio permitieron determinar nuevos mutantes tolerantes a la sequía que pudieron lograr la división y el agrandamiento celular, así como la diferenciación celular (Fig. 1). Es bien sabido que el PEG no puede atravesar la pared celular debido a su alto peso molecular y puede regular el potencial hídrico de las células embrionarias mediante el control del flujo deficiente de agua desde el xilema a las células cercanas y limita el proceso de crecimiento celular principalmente debido a la pérdida de turgencia19, lo que resulta en un deterioro de la elongación celular y la inhibición de la germinación de la semilla20. La variación de la germinación en el estrés por sequía simulado con PEG también se ha informado para otros cultivos importantes, como la alfalfa21, el trébol16 y el trigo22.

La germinación de semillas es un requisito previo inicial, pero no solo, para el establecimiento exitoso de plántulas para la tolerancia a la sequía, ya que las plántulas expuestas al estrés por sequía pueden no sobrevivir durante la recuperación o retener algunos trastornos de crecimiento en etapas posteriores de crecimiento23. Además, los resultados de condiciones de estrés hídrico simuladas en laboratorio en la etapa de germinación deben confirmarse en condiciones reales de déficit hídrico en diferentes etapas de crecimiento de las plantas24. Por lo tanto, hemos probado más 4 mutantes candidatos en condiciones de déficit de agua establecidas durante 24 días justo después del primer corte en la etapa de botón floral. Los resultados del estudio actual revelaron que los mutantes M3 mostraron una gran variación y los efectos nocivos del estrés por sequía en los parámetros agromorfológicos cambiaron según el genotipo mutante y la duración del estrés por sequía aplicado (Tabla 1). Todos los mutantes tuvieron mejores rendimientos de rebrote y toleraron mejor las condiciones de estrés por sequía que la planta de control sin riego (Z2) en los intervalos de tiempo dados, lo que sugiere que la disminución de la fotosíntesis y la disponibilidad de fotoasimilados bajo condiciones de estrés por sequía son limitadas en los mutantes en comparación con la planta de control (Tabla 1). Informes anteriores indicaron que el estrés hídrico redujo el número de hojas y el tamaño de las hojas y proporcionó una menor biomasa en la alfalfa, aunque el número de ramas laterales aumentó particularmente en condiciones de sequía severa25, lo que concuerda con los resultados correspondientes de este estudio (Cuadro 1). Las razones principales de la reducción del área foliar de la planta bajo estrés por sequía fueron la disminución de la presión de turgencia de la hoja, la temperatura del dosel y la disponibilidad de fotoasimilados debido a la disminución de la tasa fotosintética bajo condiciones de estrés por sequía26. Se demostró que la limitación estomática es uno de los principales factores de la disminución de la tasa fotosintética en condiciones de sequía leve, aunque se demostró que los factores no estomáticos, como la disminución de la fotosíntesis, son la razón principal de la disminución de la tasa fotosintética en condiciones de sequía severa26.

El estrés por sequía severo reduce el rendimiento del heno y el contenido de proteína cruda (PC) y aumenta la fibra, lo que disminuye la digestibilidad del forraje en la alfalfa, aunque el impacto del estrés por sequía en el rendimiento y la composición de la alfalfa podría variar según el cultivar de alfalfa27. Informes anteriores indicaron que el estrés por sequía disminuyó la proporción de PC a la fracción de carbohidratos solubles en agua, lo que podría reducir el excedente de N en los rumiantes27. En contraste con el contenido de proteínas de las plantas de control tanto con riego (Z1) como sin riego (Z2), el estrés por sequía aumentó el contenido de proteínas de los mutantes Y20 e Y30 mientras que no cambió en el mutante Y30 (Fig. 2). Estos hallazgos sugirieron que EMS ha causado varios tipos de mutaciones puntuales en el genoma de la alfalfa y la vía de biosíntesis de proteínas de los mutantes regulados de manera diferente en respuesta al estrés por sequía en comparación con los controles. Dado que un alto nivel de proteína es de vital importancia para la alimentación animal en condiciones de estrés por sequía, los nuevos mutantes determinados en este estudio pueden utilizarse como un recurso importante para desarrollar nuevas variedades de alfalfa tolerantes a la sequía en los programas de mejoramiento.

El estrés por sequía causa inicialmente la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que provoca daños oxidativos al impedir las funciones de los lípidos y las proteínas en las células28. Para prevenir o disminuir los efectos nocivos del estrés por sequía, las plantas utilizan un sistema de defensa antioxidante enzimático o no enzimático29, aunque el sistema de defensa enzimático generalmente se considera el más eficaz30. Las enzimas antioxidantes evitan que las ROS naturales que aparecen como resultado de las actividades metabólicas de las células dañen las estructuras subcelulares28. Es bien sabido que la producción de ROS también aumenta en respuesta al estrés por sequía28 y las enzimas antioxidantes como APX, GR y SOD juegan un papel muy importante en la desintoxicación de ROS y protegen a las células del daño potencial que puede ocurrir con el aumento de ROS31. La alfalfa tolerante a la sequía y algunas otras plantas leguminosas se vuelven más tolerantes a los efectos negativos de la sequía y el estrés salino al aumentar sus actividades enzimáticas antioxidantes 32. Los resultados de este estudio mostraron que los contenidos de SOD, APX y GR de los mutantes difieren claramente del control sin riego (Z2) (Figs. 3, 5, 6). Por ejemplo, las actividades de la enzima SOD disminuyeron el día 18 de estrés por sequía, mientras que la misma actividad enzimática aumentó el día 24 de estrés por sequía en los mutantes Y20, Y30 e Y35 en comparación con los controles y el mutante X6 (Fig. 3). Estos hallazgos sugirieron que una disminución de la actividad de la enzima SOD en el día 18 de estrés por sequía en mutantes dados puede no estar directamente relacionada con el estrés por sequía en sí, sino con los efectos de corte en la etapa de yema de floración (Fig. 3). También es posible que los mutantes puedan sentir el estrés por sequía más tarde que las plantas de control y el aumento del nivel de actividad de la enzima SOD en el día 24 del estrés por sequía indica una mejor tolerancia a la sequía en los mutantes debido a la mutación aleatoria del mutágeno EMS (Fig. . 3).

El TBARS es uno de los parámetros más comunes para detectar la oxidación de lípidos en respuesta al estrés1. El MDA es un producto desdoblado de un endoperóxido de ácidos grasos insaturados y reacciona con el ácido tiobarbitúrico (TBA) formando TBARS33. El estrés por sequía prolongada aumentó los niveles de TBARS en los mutantes X6 e Y20, mientras que se determinaron niveles similares de TBARS en los mutantes Y30, Y35 y el control sin riego (Z2), lo que sugiere que la acumulación de MDA y las actividades enzimáticas relacionadas pueden regularse de manera diferente en los mutantes X6 e Y20 en comparación a los otros mutantes6 o surgen deficiencias significativas cuando se utiliza para evaluar la peroxidación lipídica en los mutantes relacionados34. La APX y GR son las enzimas clave para el ciclo ascorbato-glutatión (AsA-GSH) y previenen la acumulación de un nivel tóxico de H2O2 en organismos fotosintéticos bajo condiciones de estrés35. Aunque se ha demostrado que las actividades de APX y GR aumentan bajo diversas condiciones de estrés, incluida la sequía en diferentes especies de plantas32, estas actividades enzimáticas se encontraron significativamente más bajas en los mutantes que en las dos plantas de control en este estudio, lo que sugiere que el daño oxidativo no ocurrió en absoluto en los mutantes o tuvo menos efectos nocivos en los mutantes en comparación con las plantas de control.

Los niveles transcripcionales y postranscripcionales de los genes relacionados con el estrés abiótico en las plantas cambian en condiciones de déficit hídrico36. Los resultados de este estudio revelaron que el patrón de expresión de los genes MtP5CS, MtDehyd, MseIF-2, MtRD2 y MsNAC relacionados con la sequía se regulaba diferencialmente en los mutantes en comparación con las plantas de control (Fig. 7). La presencia de regulación negativa de todos los genes se pudo observar en el mutante X6 en ambos intervalos de tiempo de estrés por sequía (18 días y 24 días), mientras que el patrón de regulación de genes de los otros mutantes cambió según el tiempo y la duración del estrés por sequía (Fig. 7). ). El nivel de expresión del gen MtP5CS en el día 18 de estrés por sequía fue significativamente menor en los mutantes que en el control Z2 con la excepción del mutante X6, mientras que el estrés por sequía prolongado provocó una regulación a la baja del mismo gen (Fig. 7). Los niveles de expresión de los genes MtDehyd, MseIF-2 y MtRD2 en el día 18 de estrés por sequía aumentaron en los mutantes Y20, Y30 e Y35, aunque el control Z2 mostró un nivel de expresión más bajo que los mutantes en el mismo intervalo de tiempo (Fig. 7) . Por otro lado, el estrés por sequía prolongado (24 días) provocó una severa regulación a la baja de los genes MtDehyd, MseIF-2 y MtRD2 en los mutantes, aunque el control Z2 no tenía o tenía un nivel de expresión más bajo que los mutantes (Fig. 7). Se observaron regulaciones hacia arriba y hacia abajo de la expresión del gen MsNAC en los mutantes en ambos intervalos de tiempo (18 días y 24 días), mientras que el mismo gen regulaba significativamente hacia arriba en la planta de control sin riego (Z2) en intervalos de tiempo dados. Estos resultados indicaron que los mutantes tienen un modo de acción diferente en respuesta al estrés por sequía y las regulaciones transcripcionales de los genes relacionados con la sequía probados en este estudio proporcionaron una alerta temprana para que los mutantes se vuelvan más tolerantes al estrés por sequía prolongado en comparación con el control. Los resultados de las expresiones génicas relacionadas con la sequía también mostraron una concordancia con los niveles de actividad enzimática determinados en los mutantes en el día 18 de estrés por sequía (Fig. 7), excepto TBARS. Las plantas de control mostraron actividades enzimáticas SOD, APX y GR más altas que los mutantes en el día 18 de estrés por sequía, mientras que los mutantes Y20 e Y30 tenían niveles más bajos de enzimas APX y GR en el día 24 de estrés por sequía que las plantas de control (Fig. 7) . Estos hallazgos sugirieron que la regulación transcripcional y postranscripcional de los mutantes tenía un modo de acción único en respuesta a condiciones de estrés por sequía dadas en comparación con los controles.

En conclusión, los resultados de este estudio revelaron que el cribado de semillas de alfalfa M3 en un ensayo de crecimiento de raíces suplementado con 35 % de PEG600 pudo determinar nuevos mutantes tolerantes a la sequía que también toleraron las condiciones de déficit de agua aplicadas durante 24 días después del primer corte en el botón floral. escenario. Sin embargo, los nuevos genotipos de alfalfa tolerantes a la sequía determinados en este estudio deben evaluarse más a fondo en condiciones de campo para el rendimiento del heno, la calidad nutricional, la capacidad de fijación de nitrógeno y la sostenibilidad.

Confirmamos que la investigación experimental y los estudios de campo sobre plantas (ya sean cultivadas o mutantes), incluida la recolección de material vegetal, se realizaron de acuerdo con las directrices y leyes institucionales, nacionales e internacionales pertinentes. Las semillas de 200 g (el peso de mil semillas es de aproximadamente 2 g) de alfalfa (Medicago sativa L.) cultivar Bilensoy-80 se mutagenizaron usando metanosulfonato de etilo (EMS) al 0,15% durante 12 h como se indica en la literatura37,38. Se obtuvieron aproximadamente 470 g de semillas M2 de las plantas M1 cultivadas en el campo. Las semillas M2 se plantaron con un espacio bruto de 70 cm. Las plantas M2 se aislaron con una bolsa de aislamiento en la etapa de brotación temprana y se dejaron para la autofecundación, que continuó aproximadamente un mes durante los períodos de floración. Las vainas de esas plantas se cosecharon a mano y se desecharon manualmente. Se utilizaron un total de 340.675 semillas M3 para el cribado in vitro utilizando el ensayo de crecimiento de raíces que se indica a continuación.

Las semillas M3 se trataron con etanol puro durante 10 min, luego se mantuvieron en una solución que contenía HCl (0,5 ml/100 ml) y HgCl2 (0,2 g/100 ml) durante 20 min y luego se lavaron con dH2O estéril durante 5X. Se vertió medio MS de potencia media que contenía 5 g/l de sacarosa, agar al 1 % y tampón MES 2 mM con pH 5,7 en placas de Petri de plástico desechables (estériles, 3 × 15 cm) en condiciones asépticas y se dejó enfriar. Para inducir el estrés por sequía, se añadió 35 % de PEG en la parte superior del medio MS de potencia media solidificado utilizando el método de infiltración (Fig. 1)2,39. Las semillas del cultivar Bilensoy-80 se usaron como control (Fig. 1B). Las placas de Petri, cubiertas con cinta porosa 3 M Micropore, se mantuvieron a 4 °C durante 48 h para romper la posible latencia de las semillas. Posteriormente, las cajas de petri se incubaron en condiciones de oscuridad constante durante 3 días a 25 °C y durante otros 4 días a 25 °C en posición vertical en una cámara de crecimiento de plantas controladas con una luz de 12 h (350 µmol m−2 s −1)/ciclo de oscuridad15,39.

Las semillas que germinaron y mostraron una buena elongación de la raíz se identificaron como mutantes candidatos tolerantes a la sequía (Fig. 1C, D) y se retiraron de las placas de Petri con unas pinzas y se transfirieron a violas (5 × 5 cm) llenas de una mezcla de turba y perlita ( 3:1 v/v) (Fig. 1E). Las violas se mantuvieron durante 14 h de luz (350 µmol m−2 s−1) hasta que las primeras hojas verdaderas de trébol fueron visibles (Fig. 1F) a 20 °C y 65% ​​de humedad en condiciones de crecimiento. Las plántulas que mostraban las primeras hojas verdaderas (tres folíolos, 7–10 cm de altura de la plántula) se transfirieron luego a las macetas (30 cm × 30 cm) que contenían una mezcla de turba y perlita (3:1 v/v) (Fig. 1G). Las plantas se cultivaron hasta la etapa de yema en condiciones de crecimiento dadas como se describió anteriormente (Fig. 1H).

Los mutantes candidatos fueron reevaluados bajo condiciones de déficit hídrico aplicadas durante 24 días después del primer corte en etapa de yema. Los mutantes M3 se cultivaron en las condiciones dadas como se describió anteriormente hasta que se hicieron visibles los primeros botones florales del tallo principal y se cortaron a una altura de 5 cm (Fig. 1H). Luego se regaron las macetas hasta que alcanzaron la capacidad de agua de campo y se dejaron 24 h para permitir el drenaje del agua6,40. No se aplicó riego a esas macetas durante un total de 24 días y las muestras de hojas se tomaron a los días 0 (control, antes del corte), 18 y 24 del estrés por sequía, y se almacenaron inmediatamente a -80 °C hasta que se usaron para fines fisiológicos y fisiológicos. análisis molecular Los parámetros agromorfológicos también se determinaron en intervalos de tiempo dados de estrés por sequía y los resultados se compararon con controles con riego (Z1) y sin riego (Z2)6.

La longitud del tallo principal, el grosor del tallo principal, el número de ramas, el número de hojas, la longitud y el ancho del folíolo medio y las temperaturas del dosel de la planta se determinaron en el día 18 y 24 de estrés por sequía. Se usaron cinco vainas elegidas al azar de cada planta para determinar el rendimiento de semillas por vaina y se determinó la cantidad de semillas M4 obtenidas de cada planta (g/planta). El grosor del tallo principal se determinó entre la 2ª y la 3ª rama del tallo principal midiendo con un calibre divisor de 0,1 mm. El largo y ancho de los folíolos medios se determinaron a partir de las hojas 4 y 5 del tallo principal6. Antes de tomar muestras de hojas, se determinaron las temperaturas de las plantas mediante un termómetro infrarrojo (IR988) marcado con láser en 3 puntos diferentes pertenecientes a la parte inferior, media y superior de cada planta.

Los tejidos existentes en los días 0 (control, antes del corte), 18 y 24 del estrés se utilizaron para determinar el contenido de proteínas, la isoenzima superóxido dismutasa (SOD) y los niveles de sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS), la enzima ascorbato peroxidasa (APX) y Actividades de la enzima glutatión reductasa (GR) con tres replicaciones biológicas.

Se utilizó el estándar de albúmina de suero bovino (BSA) según el método de Bradford para determinar el contenido de proteína soluble total41. El contenido de complejo de ácido tiobarbutírico (TBA)-MDA formado por este método se determinó a A532 y A600 nm en el espectrofotómetro. Los contenidos de MDA en los tejidos se calcularon utilizando la siguiente fórmula: Contenido de MDA = [(A532 − A600) × volumen de extracto (ml)]/[155 mM/cm × cantidad de muestra (mg)]. La actividad de la enzima SOD se determinó espectrofotométricamente a 560 nm según el método basado en la reducción fotoquímica de nitroazultetrazolio (NBT)42. La actividad de la enzima APX se determinó en base a la literatura dada43. La actividad total de la enzima APX en los tejidos se calculó a partir de la tasa inicial (nmol.ascorbato.min−1.mg proteína−1) utilizando el coeficiente de extinción de ascorbato (2,8 mM.cm−1). La actividad de la enzima GR se llevó a cabo como se indica en la literatura44. La actividad enzimática GR total de las muestras se calculó a partir de la velocidad inicial de la reacción (nmolNADPH.min−1.mg proteína−1) después de restar la oxidación no enzimática utilizando el coeficiente de extinción de NADPH (6,2 mM cm−1).

El aislamiento de ARN total de las muestras de hojas se completó utilizando el kit comercial de extracción de ARN (Vivantis GF-1) de acuerdo con el protocolo especificado por la empresa. La calidad de los ARN aislados se determinó mediante medición espectroscópica a 260/280 nm con un dispositivo de nanogotas y también se confirmó en gel de agarosa al 2 % mediante un sistema de electroforesis en gel dedicado para evitar diferentes contaminaciones enzimáticas (Fig. 1 complementaria).

Los ADNc de primera cadena se sintetizaron con 4 µl del kit de síntesis de ADNc de primera cadena RevertAid de ARN total (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). Las diferencias de expresión de genes específicos para el estrés por sequía se detectaron mediante RT-qPCR (StepOne 7500, Applied bioscience) utilizando los cebadores específicos de genes relevantes (Tabla 1 complementaria). Los cebadores de todos los genes se analizaron para determinar las temperaturas de unión óptimas y el estado de los amplicones antes del análisis por RT-qPCR. Además, las especificidades de los cebadores y los productos de PCR también se probaron y se confirmaron mediante análisis de curvas de fusión realizados al final del análisis de RT-qPCR. Las condiciones de RT-qPCR se aplicaron a 95 °C durante 15 min, seguidas de 40 ciclos de 95 °C durante 40 s, 55 °C durante 40 s y 72 °C durante 30 s. Al final de la reacción de PCR, el análisis de la curva de fusión se realizó a 58–92 °C. Se realizó un análisis de cinética de disociación al final del experimento para verificar la especificidad del recocido.

Como genes domésticos, los genes de referencia Ms18srRNA y MsActin se probaron simultáneamente en los análisis de RT-qPCR6,45. Como se encontró que el gen Ms18srRNA era más estable y mostraba menos variación entre repeticiones técnicas, se utilizó como control interno en las amplificaciones de RT-qPCR y los resultados se compararon con el método 2-delta-delta Ct46. Se siguieron las pautas de MIQE para todos los experimentos de qPCR47.

Los niveles de expresión génica se determinaron en los tejidos foliares tomados los días 0 (control, antes del corte), 18 y 24 de estrés por sequía con 3 repeticiones técnicas. Se utilizaron los ajustes recomendados por el manual del dispositivo (StepOne 7500, Applied bioscience) para determinar los valores umbral críticos (Ct) de los amplicones. Se repitieron los valores de desviación estándar delta Ct entre las repeticiones técnicas ≥ 0,25. En los cálculos de la cantidad relativa (2-delta-delta Ct), el valor de RQ (Relative Quantification) en la expresión del gen de control se aceptó como 1, y más de 2 veces o menos de 0,5 veces los cambios de expresión de las muestras se utilizaron en la interpretación de los resultados. Además, se utilizó un gráfico indicador logarítmico en la creación de gráficos de expresión génica, especialmente para ver los cambios en la expresión menos de 0,5 veces en comparación con el gen de referencia.

Los datos agromorfológicos (largo y ancho del folíolo medio, temperatura de la copa de la planta y número de semillas por vaina) se sometieron a ANOVA de una vía utilizando el programa del paquete SAS48. Los parámetros fisiológicos se analizaron de acuerdo con los métodos en las referencias relevantes especificadas en la sección de métodos. Las diferencias entre las medias de los datos se probaron con la prueba LSD al nivel de P < 0,05. Los datos moleculares se normalizaron según el método 2-delta-delta Ct utilizando el gen Ms18srRNA como control interno y se determinaron los niveles de expresión de los genes relevantes46,49. Las diferencias significativas al nivel de p < 0,05 se indicaron con letras diferentes encima de las columnas de cifras.

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Descargar referencias

El apoyo financiero de este estudio fue proporcionado por el Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TUBITAK) con la beca de investigación TOVAG-116O417. Nos gustaría agradecer al Dr. Melih Taskin que nos permitió usar RT-qPCR. También nos gustaría agradecer a Huseyin Keles y Semun Tayyar por su ayuda en la cosecha y la autofecundación en el campo, respectivamente. También nos gustaría agradecer a Enes Gokhan Yilmaz, Beste Celep, Erman Cavusoglu y miembros anónimos del laboratorio que ayudaron durante los experimentos de laboratorio y el crecimiento mutante en condiciones de control.

Departamento de Biotecnología Agrícola, Facultad de Agricultura, Universidad Canakkale Onsekiz Mart, Campus Terzioglu, 17000, Canakkale, Turquía

Iskender Tiryaki, Ugur Sari y Selcuk Cetin

Departamento de Biología, Facultad de Artes y Ciencias, Universidad Canakkale Onsekiz Mart, 17100, Canakkale, Turquía

Okan Acar

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TI concibió la idea, concedió apoyo financiero, planeó los experimentos, realizó el análisis, interpretó los datos, diseñó las figuras y redactó el manuscrito. Detección concebida en EE. UU. y análisis de RT-qPCR. SC recopiló datos relacionados con parámetros agromorfológicos y prestó asistencia técnica durante la investigación y OA realizó análisis enzimáticos. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Iskender Tiryaki.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Tiryaki, I., Sari, U., Cetin, S. et al. Mejora de la tolerancia a la sequía de mutantes de alfalfa (Medicago sativa L.) mutagenizados por EMS mediante cribado in vitro en la etapa de germinación. Informe científico 12, 12693 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16294-0

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Recibido: 15 febrero 2022

Aceptado: 07 julio 2022

Publicado: 26 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16294-0

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