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Sep 19, 2023

ARTÍCULO RETIRADO: Un edulcorante natural de alimentos con anti

Oncogénesis volumen 5, página

Oncogénesis volumen 5, página e217 (2016)Citar este artículo

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Este artículo fue retractado el 16 de marzo de 2023

Un Corrigendum a este artículo fue publicado el 10 de abril de 2017

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Mogroside V es un triterpenoide aislado de la planta medicinal china tradicional Siraitia grosvenorii. Mogroside V tiene un alto grado de dulzura y un bajo contenido calórico. En este documento, encontramos que el mogroside V posee actividad inhibidora del crecimiento tumoral en modelos in vitro e in vivo de cáncer de páncreas al promover la apoptosis y la detención del ciclo celular de las células de cáncer de páncreas (células PANC-1), que en parte puede estar mediada por la regulación de STAT3. vía de señalización. Estos resultados se confirmaron in vivo en un modelo de xenoinjerto de ratón de cáncer de páncreas. En los tumores de xenoinjertos, Ki-67 y PCNA, los marcadores de proliferación de células tumorales más utilizados, se regularon a la baja después de la administración intravenosa de mogroside V. Los ensayos de etiquetado de extremos de muesca de dUTP de desoxinucleotidil transferasa terminal mostraron que el tratamiento con mogroside V promovió la apoptosis de las células de cáncer de páncreas en el tumores de xenoinjerto. Además, encontramos que el tratamiento con mogroside V redujo significativamente la expresión de vasos sanguíneos marcados con CD31 y del factor de crecimiento endotelial vascular factor proangiogénico en los xenoinjertos, lo que indica que mogroside V podría limitar el crecimiento de tumores pancreáticos al inhibir la angiogénesis y reducir la vascularización. densidad. Por lo tanto, estos resultados demuestran que el compuesto natural de sabor dulce mogroside V puede inhibir la proliferación y supervivencia de las células de cáncer de páncreas a través de múltiples objetivos biológicos.

El cáncer representa una importante amenaza para la salud humana y afecta gravemente la calidad de vida. Por ejemplo, los pacientes con cáncer experimentan fatiga, debilidad y altos niveles de dolor. Además, los medicamentos de quimioterapia utilizados en el tratamiento del cáncer tienen numerosos efectos secundarios que también afectan gravemente la calidad de vida. Por lo tanto, es particularmente importante aumentar la eficacia de los medicamentos contra el cáncer y reducir los efectos secundarios de la quimioterapia para garantizar un curso de quimioterapia sostenible y eficaz.

La quimioterapia es una de las terapias antitumorales más importantes. Los fármacos quimioterapéuticos pueden mejorar en gran medida la calidad de vida y prolongar la supervivencia y, por lo tanto, la búsqueda de fármacos quimioterapéuticos de alta eficacia con baja toxicidad es un objetivo importante de la investigación oncológica. Aunque la selección de compuestos farmacológicamente activos en plantas es un enfoque importante para desarrollar nuevos fármacos, las plantas que pueden contener compuestos farmacológicamente activos están ampliamente distribuidas y son numerosas, y los compuestos son complejos. Por lo tanto, la selección aleatoria de medicamentos derivados de plantas es laboriosa. La medicina tradicional china utiliza plantas que han demostrado ser clínicamente efectivas durante miles de años, lo que proporciona un gran recurso para el desarrollo de fármacos.1, 2 Por lo tanto, la detección de compuestos únicos que tienen una eficacia particularmente alta en las hierbas medicinales chinas puede ser un enfoque importante para desarrollar nuevas terapias.

Entre las plantas comúnmente utilizadas en la medicina tradicional china se encuentra la Siraitia grosvenorii, una planta endémica de China que se cultiva principalmente en la provincia de Guangxi, que representa más del 90 % de la producción mundial de S. grosvenorii. En 1997, el Ministerio de Salud de China aprobó las saponinas de S. grosvenorii como edulcorante en varios tipos de alimentos. Las saponinas de S. grosvenorii son los principales compuestos edulcorantes de S. grosvenorii y son cientos de veces más dulces que la sacarosa.

S. grosvenorii se encuentra entre el primer grupo de fármacos 'medicinales y comestibles' incluidos en la Farmacopea de la República Popular China,3 que enumera los efectos principales de S. grosvenorii como 'liberador de calor y humectante pulmonar, beneficioso para la faringe y la voz, facilitando el movimiento intestinal y actuando como laxante.' Actualmente, los estudios sobre S. grosvenorii se centran en su potencial antioxidante,4, 5 antiinflamatorio6 y reductor de lípidos y azúcar en sangre.7 Sin embargo, hasta el momento, los numerosos estudios sobre S. grosvenorii no han sido lo suficientemente exhaustivos. En particular, no han logrado proporcionar un mecanismo de acción claro ni caracterizar los efectos farmacológicos completos de esta planta medicinal. En particular, no se ha explorado el uso de S. grosvenorii en el desarrollo de fármacos contra el cáncer de páncreas.

El cáncer de páncreas es una enfermedad maligna que afecta el metabolismo de la glucosa8, 9. Por lo tanto, los pacientes con cáncer de páncreas deben evitar la ingesta excesiva de azúcar, ya que el consumo excesivo crónico de azúcar aumenta el riesgo de cáncer de páncreas. Sin embargo, la mayoría de las personas consumen alimentos y bebidas dulces en la vida cotidiana. Por lo tanto, un medio para proporcionar un tratamiento contra el cáncer junto con un edulcorante clínicamente aprobado sería particularmente beneficioso para los pacientes con cáncer de páncreas. En este documento, se observó que el mogroside V extraído de S. grosvenorii inhibía la proliferación y supervivencia de células de cáncer de páncreas a través de la vía STAT3 tanto in vivo como in vitro. Estos resultados indican que el mogroside V puede ser un fármaco anticancerígeno prometedor para el uso diario con relativamente pocos efectos secundarios.

Examinamos los efectos de mogroside V (Figura 1a) sobre la proliferación de células PANC-1 y otros tipos de tumores en cultivo de células líquidas utilizando el ensayo MTT. Como se muestra en la Figura 1b, el mogroside V inhibió la proliferación de células de cáncer de páncreas y otros tipos de células tumorales de manera dependiente de la dosis y el tiempo, y mostró muy poca citotoxicidad contra la línea de células epiteliales no tumorigénicas L02. Para determinar aún más si los efectos antiproliferativos de mogroside V estaban relacionados con la inducción de apoptosis y/o necrosis, las células tratadas con mogroside V se analizaron con ensayos de etiquetado de extremo de muesca dUTP de desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL). Tras 24 h de tratamiento con mogroside V, el porcentaje de células positivas para TUNEL aumentó de forma dependiente de la concentración, variando desde el 2,91 % en las células control no tratadas hasta el 92,25 % en las células tratadas con 250 μmol/l de mogroside V (Figura 1c).

Mogroside V inhibe la proliferación e induce la apoptosis en células cultivadas. ( a ) Estructura química del mogroside V extraído de S. grosvenorii. (b) Gráfico de los resultados del ensayo MTT que indica la tasa de inhibición de la proliferación celular en PANC-1 y otros tipos de células tumorales tratadas con mogroside V. (c) Imágenes representativas de células sembradas en portaobjetos para ensayos de apoptosis de reacción TUNEL. El porcentaje de células que experimentan apoptosis aumentó con el aumento de las concentraciones de mogroside V. Los resultados se obtuvieron en tres experimentos independientes.

Para investigar más a fondo la inhibición de la proliferación celular y la viabilidad por parte del mogrosido V, se examinaron la apoptosis y la distribución del ciclo celular de las células PANC-1 tratadas con concentraciones de mogrosido V que oscilaban entre 0 y 250 μmol/l mediante citometría de flujo. Los ensayos de citometría de flujo de anexina V revelaron que el mogroside V causaba apoptosis en células PANC-1. Como se ilustra en las Figuras 2a yb, el mogrosido V indujo la apoptosis en las células PANC-1 de una manera dependiente de la concentración y el tiempo. Además, encontramos que z-VAD-fmk, un inhibidor general de caspasa, inhibió la apoptosis de las células PANC-1 inducida por el tratamiento con mogroside V durante 48 h (Figura 2c). Además, se observó un aumento dependiente de la concentración de mogroside V en la relación G0/G1, que alcanzó un aumento de 1,7 veces después de la exposición a la dosis más alta (250 μmol/l) en comparación con las células no tratadas (Figura 2d).

Análisis de apoptosis y ciclo celular de células PANC-1 tratadas con mogroside V. (a) Gráficos de citometría de flujo representativos de ensayos de anexina V que indican que el mogroside V indujo apoptosis en células PANC-1 de manera dependiente de la concentración y (b) un tiempo- manera dependiente. ( c ) Las células PANC-1 se trataron con o sin mogroside V (20 μmol/l) durante 48 h en presencia o ausencia del inhibidor de la apoptosis zVAD (20 μmol/l). ( d ) Gráfico que indica las etapas del ciclo celular que se analizaron mediante citometría de flujo. Se indica el porcentaje de células en la fase G0/G1, S o G2/M del ciclo celular. Se observó un aumento en la población de G0-G1 en las células tratadas con mogroside V. Los resultados se obtuvieron en tres experimentos independientes.

La vía STAT3 tiene un papel importante en el crecimiento, la proliferación y la supervivencia celular, y está implicada en varios tipos de cáncer humano10, 11. Por lo tanto, evaluamos el efecto del tratamiento con mogroside V en esta vía de señalización en células PANC-1 mediante ensayos de Western blot. . Encontramos que el nivel de STAT3 fosforilado (p-STAT3) en las células PANC-1 se redujo después del tratamiento con mogroside V durante 24 h (Figura 3). Además, examinamos si el mogroside V moduló la expresión de proteínas involucradas en la regulación del ciclo celular y las vías apoptóticas que están aguas abajo de la vía STAT3. La expresión de los inhibidores de la ciclina quinasa CDKN1A (p21WAF1) y CDKN1B (p27)12, 13, 14, que están asociados con la detención del ciclo celular en la fase G0-G115, se incrementó con el mogroside V de forma dependiente de la dosis después de 24 H. Por el contrario, la expresión de los reguladores del ciclo celular proproliferativos CCND1 (ciclina D1), CCNE1 (ciclina E1) y CDK2 disminuyó después del tratamiento con mogroside V.16 Además, disminuyó la expresión de las proteínas antiapoptóticas BCL2L1 y BCL2, mientras que el de las proteínas proapoptóticas CASP3 y BAX aumentó después del tratamiento con mogroside V de 24 h. Además, el mogroside V suprimió la fosforilación de las quinasas aguas arriba de STAT3, incluidas las de JAK2 y TYK2 (Figuras 3c y d).

El efecto de mogroside V en la vía STAT3. Las células PANC-1 se expusieron a diversas concentraciones de mogroside V durante 24 horas y las proteínas diana se detectaron mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos. ( a ) La fosforilación de STAT3 (p-STAT3) y la expresión de proteínas aguas abajo de la vía STAT3 se suprimieron en las células tratadas con mogroside V. (b) Una representación tentativa de la regulación de la vía de señalización de STAT3 en células PANC-1 por mogroside V. (c) La fosforilación de STAT3 a p-STAT3 y la expresión de proteínas de STAT3, P-JAk2, JAK2, P-TYK2 y TYK2 en células PANC-1 tratadas con mogroside V y células MiaPaCa-2 ( d ) se examinaron mediante transferencia Western. La expresión de beta-actina sirvió como control de carga. Los resultados se obtuvieron en tres experimentos independientes.

Para determinar la capacidad de mogroside V para inhibir el crecimiento tumoral in vivo, evaluamos la actividad antitumoral de mogroside V contra tumores PANC-1 en un modelo de xenoinjerto de ratón desnudo inyectando por vía intravenosa a ratones experimentales con diferentes dosis de mogroside V 3 días/semana durante 5 semanas. El crecimiento tumoral se inhibió significativamente en los ratones tratados con mogroside V en todas las dosis evaluadas en comparación con los ratones de control (Figura 4a). Se sacrificaron los ratones y se anatomizaron los tumores 35 días después del xenoinjerto. El volumen medio del tumor en los ratones de control fue de 278,6±0,03 mm3 en comparación con 56,4±0,11 mm3 en los ratones tratados con dosis alta de mogroside V (disminución del 79,7%; P<0,001). El peso total del tumor en el grupo de control fue de 32,2 ± 1,4 g, mientras que fue de solo 9,2 ± 1,8 g en los ratones que habían recibido el tratamiento con dosis altas de mogroside V (disminución del 71,4 %; Figura 4b). Las tasas de supervivencia general se estimaron mediante el método de Kaplan-Meier, lo que confirma la asociación entre el tratamiento con mogroside V y la supervivencia (ver Figuras 4c para la curva de supervivencia). Nuestros datos demostraron que el mogroside V no solo podría aumentar la supervivencia de los ratones utilizados para el modelo de cáncer de páncreas in vivo, sino también la de los ratones utilizados para los modelos de xenoinjerto in vivo de cáncer de colon HT29 y cáncer de laringe HEP-2 (Figura complementaria S1). Los resultados de estos experimentos con xenoinjertos coincidieron con los datos in vitro que se muestran en la Figura 1b e indicaron que el mogroside V podría ser un potente inhibidor del crecimiento tumoral.

Mogroside V inhibe el crecimiento tumoral de células PANC-1 en un modelo de tumor de xenoinjerto de ratón. A los ratones se les implantaron células PANC-1 y se dividieron aleatoriamente en cinco grupos: un grupo de control, NC (solución salina normal) y tres grupos de tratamiento que recibieron dosis de 2, 10 o 30 mg/kg pc de mogroside V tres veces por semana. (a) El volumen promedio de los xenoinjertos tumorales en los cinco grupos, medido con calibradores vernier después de sacrificar los ratones y anatomizar el tumor 35 días después del tratamiento. (b) El peso promedio de los xenoinjertos tumorales en los cinco grupos. El peso del tumor fue significativamente menor en los grupos de tratamiento con mogroside V que en los grupos de control y NC. Para el análisis estadístico, los ratones tratados con mogroside V se compararon con los ratones de control con vehículo usando las pruebas t de Student; **P<0,01 y ***P<0,001 frente a los valores de control. ( c ) El análisis de supervivencia de Kaplan-Meier mostró que el tratamiento con mogroside V se correlacionó significativamente con la supervivencia general (P <0.01, usando la prueba de rango logarítmico, P <0.05 se consideró significativo).

Los mecanismos potenciales subyacentes a la inhibición del crecimiento tumoral por mogroside V in vivo se evaluaron con ensayos IHC que detectan la muerte celular, la proliferación celular y la angiogénesis. La tinción TUNEL de secciones de tejido (Figura 5) reveló que más células eran TUNEL positivas en la dosis baja (57,8 % TUNEL positivo), la dosis moderada (73,1 % TUNEL positivo) y la dosis alta (82,1 % TUNEL positivo) grupos de mogroside V en comparación con células en el grupo de control (5,2% TUNEL-positivo), lo que indica que mogroside V indujo una alta tasa de apoptosis en células tumorales PANC-1.

Análisis inmunohistoquímico de la apoptosis tumoral del xenoinjerto de células PANC-1. Las células se tiñeron usando el método TUNEL y se puntuaron para la apoptosis en comparación con el control del vehículo. Las imágenes de la izquierda ilustran el nivel de tinción de TUNEL en las células PANC-1 que comprenden el tumor en los grupos de tratamiento de control y mogroside V. Los gráficos de la derecha indican un aumento dependiente de la concentración de mogroside V en la tinción de TUNEL según lo determinado por el conteo de secciones de tejido de ocho tumores independientes. Para el análisis estadístico, los ratones tratados con mogroside V se compararon con los ratones de control con vehículo usando las pruebas t de Student; ***P<0,001 frente a los valores de control.

A continuación, evaluamos la proliferación celular en los tumores mediante IHC para detectar PCNA y Ki-67. El número de células que expresan estos marcadores disminuyó significativamente en todos los grupos de tratamiento con mogroside V en comparación con los grupos de control (P<0,001) (Figura 6). La expresión de ARNm de PCNA y Ki-67 in vivo se evaluó mediante ensayos de PCR en tiempo real (RT-PCR) (Figura 6). Mogroside V redujo claramente la expresión de ARNm de PCNA y Ki-67, lo que estaba de acuerdo con los datos de IHC que se muestran en la Figura 6 (P<0,001). Tomados en conjunto, estos datos indicaron que el mogroside V inhibía la supervivencia y proliferación de células tumorales.

El efecto de mogroside V en la expresión de PCNA y Ki-67 en tumores de xenoinjerto PANC-1. ( a ) Imágenes de tinción inmunohistoquímica y análisis RT-PCR que indican que el mogroside V inhibe la expresión de PCNA. ( b ) Imágenes de tinción inmunohistoquímica y análisis RT-PCR que indican que el mogroside V inhibía la expresión de PCNA. Los datos representan las medias ± sd El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student; ***P<0,001 frente a los valores de control.

Finalmente, determinamos si el mogroside V afectaba la densidad microvascular (MVD) y la angiogénesis en los tumores. Como se muestra en la Figura 7a, la expresión del factor proangiogénico factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) fue menor en los grupos de tratamiento con mogroside V (el 22,82 % de las células era VEGF+ en el grupo de dosis más alta) que en el grupo de control (64,71 % % de las células fue positivo, P<0,001); por lo tanto, hubo un 64,73 % menos de células que expresaban VEGF después del tratamiento con la dosis más alta de mogroside V. Para examinar el efecto del tratamiento con mogroside V sobre la MVD en los tumores, los vasos sanguíneos se marcaron con CD31 (Figura 7b) y la MVD se calculó según al método de Weidner. El valor de MVD (Figura 7c) en el grupo tratado con mogroside V (4,11) fue significativamente menor que en el grupo de control (37,23; disminución del 88,96 %, P <0,001). Estos resultados mostraron que el mogrosido V inhibía la angiogénesis tumoral de forma dependiente de la dosis.

Determinación de la angiogénesis por análisis inmunohistoquímico de la expresión de VEGF y CD31. La expresión de la proteína VEGF y CD31 se reguló significativamente a la baja en los tumores PANC-1. ( a ) Tinción inmunohistoquímica de VEGF en tumores de xenoinjerto de cada uno de los grupos de tratamiento de control y mogroside V indicados. (b) Imágenes representativas de la tinción inmunohistoquímica de CD31 en tumores de xenoinjerto de cada uno de los grupos de tratamiento de control y mogroside V indicados. ( c ) Gráfico de las mediciones de MVD en secciones de tumores de xenoinjerto según lo determinado por la expresión de CD31. Los datos representan las medias ± sd El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student. *P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001 frente a los valores de control.

En este estudio, se utilizó un enfoque celular y molecular para determinar los mecanismos subyacentes a la división celular y la regulación de la supervivencia tumoral PANC-1 por mogroside V. Nuestros hallazgos demostraron claramente que el tratamiento con mogroside V inhibía el crecimiento de las células tumorales, inducía la apoptosis y causaba la regresión del tumor. Además, el mogroside V inhibió la proliferación no solo de las células cancerosas del páncreas, sino también de las células cancerosas U937 y A549. Por el contrario, el mogroside V en concentraciones equivalentes tuvo un efecto mínimo en las células hepáticas humanas normales (L02) (Figura 1b). En conjunto, estos resultados sugieren que el mogroside V puede ser menos tóxico para las células normales que para las células cancerosas.

Hasta ahora, los objetivos bioquímicos del mogroside V no se habían dilucidado. Aquí, utilizando transferencia Western, demostramos que el mogroside V regula la expresión de proteína de STAT3. Además, el mogroside V inhibió los objetivos aguas abajo de la vía STAT3 que promueven la proliferación celular (CCND1, CCNE1 y CDK2), mientras que también regulaba al alza los inhibidores del ciclo celular (CDKN1A y CDKN1B). Estos efectos están de acuerdo con nuestro hallazgo de una detención del ciclo celular G0-G1 dependiente de la dosis en células PANC-1 tratadas con mogroside V. y BCL2L1)18, 19, lo que coincidió con un aumento en la expresión de las proteínas proapoptóticas CASP3 y BAX20, 21. Además, encontramos que la apoptosis de las células PANC-1 estaba parcialmente bloqueada por el inhibidor de caspasa z-VAD-fmk (Figura 2c), lo que sugiere que la apoptosis inducida por mogroside V puede estar mediada en parte a través de la vía de la caspasa.

Nuestros resultados obtenidos utilizando los modelos de xenoinjerto PANC-1 indicaron que el mogroside V inhibía potentemente el crecimiento tumoral in vivo. Además, de manera similar a nuestros hallazgos in vitro, el mogroside V también redujo la viabilidad y proliferación celular in vivo y redujo p-STAT3 en tumores PANC-1 de manera dependiente de la dosis (Figura complementaria S2). Los ensayos TUNEL revelaron que el mogroside V inducía fuertemente la apoptosis. La actividad proliferativa en tumores de xenoinjertos se evaluó mediante IHC para Ki-67 y PCNA. Ki-67 es un marcador de proliferación celular que se expresa en todas las fases del ciclo celular, excepto en la fase G022, 23. PCNA, proteína auxiliar delta de la ADN polimerasa de 36 kD implicada en la proliferación de células neoplásicas y no neoplásicas, 24, 25 se expresa específicamente en núcleos de células en proliferación y se usa comúnmente para medir la proliferación de células tumorales. La expresión tanto de Ki-67 como de PCNA se redujo en tumores de xenoinjerto PANC-1 en todos los grupos de tratamiento con mogroside V en comparación con los grupos de control y se correspondió con reducciones en el peso del tumor. Por lo tanto, el mogroside V puede actuar farmacológicamente al inhibir la proliferación de células PANC-1, al mismo tiempo que induce la apoptosis, lo que posteriormente limita el crecimiento del tumor pancreático.

Finalmente, encontramos que la expresión de VEGF y MVD estaban disminuidas en los tumores de xenoinjerto PANC-1. VEGF tiene un papel importante en la angiogénesis tanto en tumores como en tejidos sanos26, 27. Estos datos sugieren que el mogrosido V puede prevenir el crecimiento del tumor pancreático al inhibir la angiogénesis a través de un mecanismo dependiente de VEGF. En consecuencia, esto conduciría a una disminución de la MVD y, por lo tanto, a una disminución del crecimiento del tumor. STAT3 es un mediador esencial de la transcripción de VEGF al unirse directamente al promotor de VEGF, lo que induce la angiogénesis.28, 29 Nuestro estudio mostró que el mogroside V inhibía significativamente la activación de la proteína STAT3 en las células cancerosas PANC-1 junto con la reducción de los niveles de proteína VEGF in vivo . Este hallazgo sugiere que los efectos antiangiogénicos del mogrosido V pueden deberse a la capacidad del mogrosido V para prevenir la activación de STAT3.

Nuestro estudio estuvo limitado por el hecho de que no exploramos los efectos de una sobreexpresión estable de STAT3 o la eliminación de STAT3 en las células PANC-1 utilizadas como xenoinjertos tumorales. Se desconoce la eficacia del tratamiento con mogroside V en estas condiciones y será el foco de nuestros estudios futuros.

En conclusión, hemos encontrado a través de experimentos in vitro e in vivo que el mogrosido V inhibía la proliferación de células de cáncer de páncreas y promovía la apoptosis tumoral. Además, el mogroside V interfiere con la angiogénesis en los tumores pancreáticos. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que el mogroside V puede ser un compuesto anticancerígeno potencial que actúa sobre la vía STAT3. Además, demostramos que el mogroside V no solo podría prevenir la progresión del tumor in vivo, sino también aumentar la supervivencia de los ratones, lo que indica que este compuesto natural podría poseer una actividad terapéutica potencial. Dado que el mogroside V es un edulcorante natural que ha sido aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos, puede usarse para el consumo diario como aditivo en alimentos y bebidas para prevenir o tratar el cáncer de páncreas.

Mogroside V se adquirió de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, EE. UU.). Todos los demás reactivos también se adquirieron de Sigma-Aldrich a menos que se especifique lo contrario.

La línea celular de adenocarcinoma pancreático humano PANC-1 se obtuvo del Instituto de Biología Celular de Shanghai (Shanghai, China). Las células PANC-1 se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (Gibco, Grand Island, NY, EE. UU.), estreptomicina 100 μg/ml y penicilina 100 U/ml en una atmósfera humidificada con CO2 al 5 %. a 37 °C. Las líneas celulares de adenocarcinoma pancreático humano MiaPaCa-2 y CFPAC-1, adenocarcinoma de pulmón A549, U937 humano y células hepáticas humanas normales L02 se obtuvieron del Instituto de Biología Celular de Shanghái. Las células MiaPaCa-2 y CFPAC-1 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco y las células A549, U937 y L02 se cultivaron en RPMI1640. Todos los medios se complementaron con suero bovino fetal inactivado por calor (10%), estreptomicina 100 µg/ml y penicilina 100 U/ml. Las células se mantuvieron a 37 °C con 5% de CO2.

Las células se añadieron a placas de cultivo celular de 96 pocillos a una concentración inicial de 1 × 104 células/ml y se incubaron con las concentraciones indicadas de mogroside V. Después de 24 o 72 h de incubación, se añadió solución de MTT (5 mg/ml). a los pocillos y las células se incubaron durante otras 4 h. Se eliminó el medio de cultivo y se analizaron los cristales de formazán formados por oxidación del colorante MTT midiendo la absorbancia a 490 nm con un lector de ELISA30, 31.

Las células se marcaron para roturas de la cadena de ADN apoptótica mediante una reacción TUNEL utilizando el kit de detección de muerte celular in situ (POD; Roche Applied Science, Indianápolis, IN, EE. UU.) para determinar el porcentaje de células que experimentan apoptosis inducida por mogroside V, y se incubaron con antidigoxigenina peroxidasa durante 30 min usando sustrato DAB. Las células apoptóticas se visualizaron mediante microscopía óptica (Olympus, Tokio, Japón). Para cuantificar las células apoptóticas, se determinó el porcentaje de células positivas para TUNEL en una población de células cancerosas de 300 células en cinco campos aleatorios por portaobjetos de vidrio.

El estado del ciclo celular se determinó mediante citometría de flujo. Las células PANC-1 se analizaron en busca de alteraciones en su ciclo celular después del tratamiento con mogroside V durante 24 h. Las células utilizadas para los experimentos de citometría de flujo eran tanto células flotantes como adherentes. Después de fijar las células con metanol al 70 %, se trataron con RNasa A y se expusieron a yoduro de propidio para el análisis de citometría de flujo. La detección de la apoptosis se realizó mediante tinción con anexina V-FITC con un kit de ensayo de anexina V (kit de detección de apoptosis de anexina V-FITC; BD Pharmingen, San Diego, CA, EE. UU.). Brevemente, las células PANC-1 (1 × 105 células) se cultivaron con mogroside V durante 24 a 96 h, seguido de etiquetado con anexina V-FITC y yoduro de propidio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El porcentaje de células que experimentan apoptosis en el control y en las células tratadas con mogroside V se analizó usando citometría de flujo. En los ensayos de inhibición de la apoptosis, las células se incubaron con o sin mogroside V durante 48 h en presencia o ausencia del inhibidor de la apoptosis zVAD (20 μmol/l). Los resultados se evaluaron con el software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.).

Las células se trataron con mogroside V durante 24 h y se lisaron a 4 °C en tampón de lisis (Tris-HCl 0,05 M, pH 7,4, Triton X-100 al 1 %, NaCl 0,1 M, desoxicolato de sodio al 1 % y SDS al 0,1 %) que contenía fluoruro de fenilmetanosulfonilo 1 mM y un inhibidor de proteasa. El lisado de proteína insoluble se eliminó por centrifugación. Aproximadamente 15 μg de proteína de los lisados ​​​​celulares se separaron mediante SDS-PAGE al 12% y luego se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios para el análisis de transferencia Western: STAT3 (dilución 1:1000), fosfo-(p)-STAT3, CDKN1A, CDKN1B (p27), BCL2 y β-actina (todos de Sigma-Aldrich). Después de la incubación con los anticuerpos secundarios apropiados (todos de Sigma-Aldrich), las membranas se desarrollaron con ECL plus (ECL, Amersham Biosciences, GE Healthcare, Pittsburgh, PA, EE. UU.). Las mediciones densitométricas de las bandas de proteínas se realizaron utilizando el densitómetro de imágenes GS-800 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.).

Las características in vivo de los tumores pancreáticos se investigaron en un modelo de xenoinjerto de ratones desnudos BALB/c. Se mantuvieron ratones BALB/c desnudos macho de aproximadamente 8 semanas de edad de Vital River (Charles River Ltd. Co., Beijing, China) en un ambiente libre de patógenos. Para establecer un modelo de tumor de xenoinjerto, se inyectaron subcutáneamente células PANC-1 (1 × 107) en el flanco de los ratones. Los ratones se dividieron aleatoriamente en los siguientes cinco grupos: (i) grupo de control no tratado, (ii) grupo NC (solución salina normal), (iii) grupo de mogroside V con 2 mg/kg de peso corporal, (iv) grupo de mogroside V con 10 mg/kg de peso corporal y (v) 30 mg/kg de peso corporal de mogroside V. Mogroside V se disolvió en solución salina normal y se administró a los ratones en un volumen de 0,1 ml. Los tumores se midieron con un pie de rey cada 3 días. Los volúmenes de los tumores se determinaron midiendo la longitud (l) y el ancho (w) de los tumores, y calculando el volumen del tumor (V=w2l/2).32 Después de 5 semanas, los ratones se sacrificaron y los tumores se diseccionaron y pesado La tasa de inhibición del crecimiento tumoral se calculó mediante la siguiente fórmula: tasa de inhibición del crecimiento tumoral (%) = (1-MT/MC) × 100, donde MT y MC son las masas tumorales medias de los grupos de tratamiento y control, respectivamente. El uso de animales cumplió con las Directrices de Bienestar Animal de la Universidad de Agricultura de Beijing.

Después de la disección, los tejidos tumorales se fijaron inmediatamente en formalina tamponada con fosfato al 10 % y se incluyeron en parafina. La proliferación de células de cáncer de páncreas se estimó mediante tinción IHC con PCNA monoclonal de ratón o anticuerpo Ki-67 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EE. UU.), y el número de células positivas para PCNA y Ki-67 en una población de 200 células muestreadas con un aumento de × 400. Posteriormente se calcularon el índice de marcaje de antígenos nucleares de células en proliferación y el índice de marcaje de Ki-67. Después del tratamiento con mogroside V, se evaluó la vascularización en secciones de tejido inmunoteñidas con CD31 y VEGF. La DMV se calculó según el método de Weidner33, 34. La inmunohistoquímica TUNEL se realizó con un kit de detección de muerte celular in situ (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) según las instrucciones del fabricante.

Los niveles de expresión de los transcritos de ARNm de interés se determinaron mediante ensayos de RT-PCR.35 El ARN total se aisló de tejidos tumorales frescos con reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). El ARN cebado con oligo (dT) (2 μg) se transcribió inversamente con transcriptasa inversa SuperScript II (Promega, Madison, WI, EE. UU.) De acuerdo con las instrucciones del fabricante. El cDNA obtenido se usó para determinar la cantidad de mRNA de PCNA y Ki-67 mediante PCR con Taq DNA polimerasa (Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EE. UU.). Se utilizó GAPDH como control interno. Se usaron las siguientes secuencias de cebadores para la amplificación de PCNA, Ki-67 y GAPDH: PCNA adelante 5'-CCTGCTGGGATATTAGCTCCA-3' y reverso 5'-CAGCGGTAGGTGTCGAAGC-3' (Tm = 60 ° C, 109 pb); Ki-67 directo 5′-GCCTGCTCGACCCTACAGA-3′ y reverso 5′-GCTTGTCAACTGCGGTTGC-3′ (Tm=60 °C, 127 pb); GAPDH adelante 5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′ e inverso 5′-AAGTGGTCGTTTGAGGGCAATG-3′ (Tm=60 °C, 101 pb). Las muestras de PCR resultantes se analizaron mediante electroforesis en gel (1,5 % de agarosa). Las bandas de ADN se examinaron utilizando un sistema de documentación en gel (Model Gel Doc 2000; Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.).

Los datos se presentaron como las medias ± DE de tres experimentos independientes para el estudio in vitro y n=6 para el estudio in vivo. La significación estadística se determinó utilizando la prueba t de Student. La supervivencia se estimó mediante el método de Kaplan-Meier y los valores obtenidos se compararon mediante el log-rank test. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.) con P<0,05 considerado estadísticamente significativo

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Nos gustaría agradecer el apoyo de la Fundación de la Universidad de Agricultura de Beijing (No.2017516005; No.1086716276).

C Liu y LH Dai: Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

Laboratorio Clave de Agricultura Urbana (Norte) del Ministerio de Agricultura, Universidad de Agricultura de Beijing, Beijing, China

C Liu, DQ Dou y LQ Ma

Laboratorio Nacional de Ingeniería para Enzimas Industriales, Instituto de Biotecnología Industrial de Tianjin, Academia de Ciencias de China, Tianjin, China

C Liu, LH Dai y YX Sun

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Correspondencia a DQ Dou o LQ Ma.

Los autores declaran no tener conflicto de intereses.

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Liu, C., Dai, LH., Dou, DQ. et al. ARTÍCULO RETIRADO: Un edulcorante natural de alimentos con propiedades contra el cáncer de páncreas. Oncogénesis 5, e217 (2016). https://doi.org/10.1038/oncsis.2016.28

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Recibido: 30 de octubre de 2015

Revisado: 12 febrero 2016

Aceptado: 07 de marzo de 2016

Publicado: 11 abril 2016

Fecha de emisión: abril de 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/oncsis.2016.28

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