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Sep 16, 2023

Biosíntesis de mogrosidos heterólogos en pepino y tomate mediante manipulación genética

Volumen de biología de las comunicaciones

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 191 (2023) Citar este artículo

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Los mogrosidos se utilizan ampliamente como edulcorantes naturales sin calorías de alto valor que exhiben una variedad de actividades biológicas y permiten la reproducción de sabores vegetales mediante la biotecnología molecular moderna. En este estudio, desarrollamos una estrategia de apilamiento de genes basada en In-fusion para el apilamiento de transgenes y un vector multigénico que alberga 6 genes de biosíntesis de mogrosides y lo transformamos en Cucumis sativus y Lycopersicon esculentum. Aquí mostramos que el pepino transgénico puede producir mogroside V y siamenoside I a 587 ng/g FW y 113 ng/g FW, respectivamente, y tomate transgénico cultivado con mogroside III. Este estudio proporciona una estrategia para mejorar el sabor vegetal, allanando el camino para la biosíntesis heteróloga de mogrosides.

La preferencia por el sabor de los alimentos impregna toda la historia evolutiva de los humanos, y esta preferencia ocasionalmente ha sido más alta que los requerimientos nutricionales humanos. Los sabores han desempeñado un papel fundamental en la preferencia de los alimentos, y el sabor ha proporcionado una sensación de placer, lo que tiene implicaciones importantes para mejorar el apetito, la digestión y aumentar la tasa de uso de nutrientes1. Además, los seres humanos ya han comenzado a mejorar los sabores de frutas y verduras, lo que en última instancia ha llevado a la orientación del gasto dietético y la mejora de la salud humana2. Durante el último medio siglo, el objetivo de mejoramiento de la alta productividad de los cultivos ha causado indirectamente una reducción en el sabor y los nutrientes3. Debido al vínculo genético, las características de calidad parecen estar negativamente relacionadas con el rendimiento, y el sabor deseable, el alto rendimiento y la alta calidad son características complejas controladas por múltiples genes4. En general, por lo tanto, el mejoramiento de plantas para mejorar el sabor sigue siendo un gran desafío en base al alto rendimiento y la buena calidad. Desde 1983, los grandes avances en la biotecnología transgénica han permitido que el mejoramiento para mejorar el sabor y la calidad nutricional sea más simple y factible5. Como se ha demostrado anteriormente, existe una ausencia obvia de volátiles asociados con el sabor en los cultivares de tomate comerciales modernos. En consecuencia, los científicos han modificado las plantas de tomate para que los frutos presenten un sabor a limón y un aroma a rosa a través de la expresión de Ocimum basilicum geraniol sintasa6. Además, se ha reconocido ampliamente que TomLoxC afecta el sabor del fruto del tomate al catalizar la biosíntesis de compuestos volátiles C5 y C6 derivados de lípidos7. Además, investigaciones anteriores han indicado que la transformación del gen VpVAN que regula la biosíntesis de vainillina ha cambiado el sabor único de la pimienta8. Obviamente, el fitomejoramiento que involucra transgenes homólogos o heterólogos asociados con el sabor se ha convertido en un tema de investigación popular que probablemente continúe en el futuro.

La preferencia por lo dulce es una especie de instinto humano, y la dulzura ha sido descrita como un placer hedónico fundamental9. Los alimentos dulces con azúcar como ingrediente esencial han aumentado notablemente la obesidad, la diabetes y las enfermedades cardiovasculares en todos los grupos de edad en todo el mundo10; por lo tanto, es necesario explorar los edulcorantes sin azúcar para su uso en las dietas diarias. Del mismo modo, los científicos transformaron proteínas de sabor dulce en pepino11, tomate12,13, fresa14, pera15 y lechuga13,16 para la mejora de cultivos de sabor dulce. Sin embargo, las proteínas dulces estaban comúnmente limitadas por el alto precio, el suministro insuficiente, el mal sabor y la estabilidad y la vida útil cortas17. En 1983, el mogroside V, un edulcorante sin azúcar aislado de la fruta única Siraitia grosvenorii (Cucurbitaceae; Luo-han-guo o fruta del monje), se descubrió en China18,19,20 y fue aprobado por la FDA en 2010. Por lo general, Los mogrosidos se dividen en varios componentes dulces, como el mogrosido III, el siamenosido I y el mogrosido V. La dulzura de los mogrosidos difiere según el número de glicosilación y sitios de glicosilación21. La gran ventaja del mogroside V es su excelente sabor en comparación con los esteviósidos, el rubusósido y la glicirricina, que normalmente tienen un sabor dulce ligeramente amargo22,23. Curiosamente, este edulcorante natural con efectos antiglicación24 tiene un alto dulzor, tiene un bajo contenido calórico y no es tóxico; su dulzor es aproximadamente 300 veces superior al de la sacarosa25,26; y su historia de uso medicinal es >300 años27. Los mogrosides han sido aprobados y utilizados por todo tipo de marcas reconocidas en el país y en el extranjero, y se han aplicado en más de 4300 productos en todo el mundo a finales de septiembre de 2019. En China, los mogrosides se consideran una especie de edulcorante seguro, no tóxico y natural, que es ampliamente utilizado en las industrias de alimentos, bebidas y farmacéutica y tiene un gran potencial comercial a nivel mundial27. En 2011, nuestro grupo investigó la vía de biosíntesis del mogroside V, y se clonaron por primera vez 40 genes clave que codifican enzimas28, lo que proporcionó genes donantes para el mejoramiento de cultivos para mejorar el sabor dulce. Según la literatura, el precursor de la biosíntesis de mogroside V, el 2,3-oxidoescualeno, se encuentra ampliamente en las plantas29 (Fig. S1 complementaria). Por lo tanto, es de vital importancia que varios genes de mogroside V sintasa se transformen en plantas candidatas para desarrollar plantas dulces, y estas plantas transgénicas también pueden usarse como materiales prometedores para la producción de mogroside V.

Durante los últimos 30 años, muchas plantas transgénicas para las cuales se ha mejorado genéticamente un solo rasgo se han aplicado para promover el cultivo comercial en algunos países y áreas30. Con el desarrollo de la ingeniería metabólica y la biología sintética, se ha aplicado la transformación de múltiples genes para regular la biosíntesis y mejorar múltiples propiedades biológicas en lugar de la transformación de un solo gen, que es una tendencia emergente en el mejoramiento genético31. Hasta la fecha, ha habido numerosos avances en plantas modificadas genéticamente para la biofortificación de micronutrientes, fitonutrientes y componentes bioactivos, como el arroz dorado enriquecido con β-caroteno32, papa33, plátano34 y canola35, antocianina-36, L-DOPA-37, folato38 y flavonol-39, frutos de tomate biofortificados con betalaína40, que se desarrollaron a través de la transformación multigénica que involucra vías de biosíntesis de metabolitos específicos. Para lograr la síntesis de novo de mogroside V, el problema clave es la integración de 6 genes de biosíntesis de mogrosides en plantas candidatas. Por lo tanto, desarrollamos un sistema de expresión multigénica simple y eficiente basado en la tecnología In-fusion y péptidos 2A autoescindibles. Además, se introdujeron con éxito 6 genes de mogroside V sintasa en pepino y tomate, y todos los genes tenían altos niveles de transcripción en las plantas transgénicas. En consecuencia, desarrollamos una planta transgénica de pepino dulce con mogroside V y tomate ligeramente dulce con mogroside III (MIII) en primer lugar. Este estudio describe una amplia aplicación prospectiva en el campo de la mejora de sabores de frutas y verduras y proporciona un modelo valioso y cautivador para desarrollar germoplasmas de plantas excepcionales con ciertas características y sabores múltiples.

Los promotores AtUBQ10 y AtPD7 se aislaron de Arabidopsis thaliana y se ligaron en un vector pBI121 junto con el gen informador GUS (Fig. 1a). Para evaluar la idoneidad de los promotores, se realizó una expresión transitoria en los cotiledones de Cucumis sativus como se describió anteriormente41. Se infectaron hojas de Nicotiana benthamiana y cotiledones de Cucumis sativus con Agrobacterium que albergaba pBI121 en el que el gen GUS estaba dirigido por los promotores AtUBQ10, AtPD7 y CaMV 35S en las mismas condiciones. Para caracterizar la función de estos promotores, se realizó tinción histoquímica como se describió anteriormente42. Como era de esperar, hubo un alto nivel de actividad GUS bajo el control de los promotores AtUBQ10 y AtPD7 en Cucumis sativus y Nicotiana benthamiana (Fig. 1b, c), y el nivel de expresión más alto se detectó 5 días después de la infiltración de Cucumis sativus. Por lo tanto, la capacidad de los promotores AtUBQ10 y AtPD7 para impulsar la transcripción génica en Cucumis sativus y Nicotiana benthamiana fue comparable a la del promotor CaMV 35S, y no hubo diferencias significativas entre estos promotores (Fig. 1b y Fig. 1c). Por lo tanto, estos promotores podrían usarse como promotores constitutivos fuertes para impulsar la expresión génica en el vector multigénico.

un plásmido recombinante con diferentes promotores. b Ensayo histoquímico GUS de expresión transitoria en pepino. c El ensayo histoquímico GUS de expresión transitoria se realizó después de 48 h de infiltración en tabaco. Las plantas WT se usaron como controles negativos. 35S pro: promotor CaMV 35S; AtUBQ10 pro: promotor AtUBQ10; AtPD7 pro: promotor de AtPD7.

Se ha demostrado ampliamente que el precursor de la biosíntesis de mogrosidos es el 2,3-oxidoescualeno, que se sintetiza a través de la vía del mevalonato y es catalizado por una serie de enzimas para sintetizar mogrosido V en Siraitia grosvenorii (Fig. S1 complementaria). Por lo tanto, el plásmido binario pCAMBIA1300 que alberga los genes SgSQE1, SgCS, SgEPH2, SgP450, SgUGT269-1 y SgUGT289-3 que codifican enzimas relacionadas con la síntesis de mogrosidas junto con el gen de resistencia Hyg (Hyg, marcador de selección) impulsado por AtPD7, AtUBQ10 y CaMV 35S Los promotores se construyeron mediante tecnología In-fusion y péptidos 2A autoescindibles (Fig. S2a complementaria). Primero, todos los genes diana se ligaron en pBI121 o pCAMBIA1300 para producir el primer casete de expresión génica. En segundo lugar, la región que albergaba el promotor, el gen diana y el terminador se clonó y se ligó en pCAMBIA1300 para producir un casete de expresión de doble gen. Luego, combinando el primer casete de expresión génica y el casete de expresión de doble gen, construimos un casete de expresión de triple gen. Finalmente, los casetes de expresión de genes triples se ligaron en el vector final mediante péptidos P2A. (Fig. S2a complementaria). El plásmido U22p-SCE correspondiente se identificó mediante PCR (Fig. S2b complementaria). Este vector de expresión multigénica era grande (la longitud desde el borde izquierdo hasta el borde derecho era ~21,5 kb) y se usó para sintetizar mogrosidas. El plásmido U22p-SCE se introdujo en Agrobacterium tumefaciens GV3101 y los transformantes se utilizaron posteriormente para la transformación genética.

Para confirmar aún más la disponibilidad de los vectores multigénicos, se realizó un ensayo de expresión transitoria en Cucumis sativus. Todos los genes relacionados con la biosíntesis de mogrosides se expresaron en los cotiledones de Cucumis sativus mediante agroinfiltración. De acuerdo con los métodos de nuestro estudio preliminar, tomamos muestras de los cotiledones de Cucumis sativus a los 5 días y los cotiledones de las hojas de tabaco a las 48 horas después de la infiltración para el análisis HPLC-ESI-MS/MS. Como se indica en las figuras complementarias S3a y S3b, MII-E y MIII se acumularon ligeramente en los cotiledones de Cucumis sativus transformados con el vector de expresión multigénica U22p-SCE, pero no se detectó MI-A1. Desafortunadamente, no se observó SI ni MV en el ensayo de expresión transitoria múltiple. La falta de acumulación de SI y MV sugirió al menos dos posibilidades: (i) el ensayo de expresión transitoria generalmente duró poco tiempo, en este caso, la acumulación de sustrato MIII fue inadecuada para la producción de SI y MV en los cotiledones de (Cucumis sativus), y (ii) el vector de expresión multigénica era demasiado grande para suprimir la expresión génica, lo que resultó en la reducción de MII-E y MIII. No obstante, el ensayo de expresión transitoria confirmó que estaba disponible el vector de expresión multigénica. Por lo tanto, se requiere la transformación estable de vectores de expresión multigénica para su transformación genética en Cucumis sativus y Lycopersicon esculentum, lo que proporciona una nueva idea sobre el mejoramiento de vegetales que acumulan mogrosidos.

Para mejorar las características nutricionales del pepino, se introdujo el vector de expresión multigénica U22p-SCE en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens y se diseñó genéticamente la vía biosintética de mogrosides para producir mogrosides en plantas de pepino. Alrededor de 500 explantes de hojas de pepino se sometieron a transformación mediada por Agrobacterium con el vector U22p-SCE. Entre estas, el número total de líneas resistentes a Hyg fue de aproximadamente 15, pero muchas líneas resistentes a Hyg no pudieron enraizar, sobrevivir y crecer en las plántulas. Finalmente, solo se cultivaron 5 plantas transgénicas en el invernadero después de la domesticación y el trasplante. Todas las plantas transgénicas y las plantas no transformadas se cultivaron en el invernadero con un entorno de crecimiento constante (Fig. 2a). Para detectar la integración de los transgenes en el genoma de las plantas de pepino (Fig. 2b), se extrajo ADN genómico para determinar la presencia de genes objetivo y genes Hyg utilizando cebadores específicos de genes por PCR (Tabla complementaria S4). Se detectaron fragmentos del tamaño esperado en todas las líneas transgénicas resistentes a Hyg (Fig. 2c). Un fragmento de SgSQE1 de 1587 pb, un fragmento de SgCS de 2280 pb, un fragmento de SgEPH2 de 951 pb, un fragmento de SgP450 de 1421 pb, un fragmento de SgUGT269-1 de 1253 pb, un fragmento de SgUGT289-3 de 1026 pb y un fragmento de 392 pb del gen de resistencia Hyg. se detectaron simultáneamente en una planta transgénica (U1) pero no se amplificaron a partir de plantas de pepino WT (Fig. 2c). Otras plantas casi nunca existieron los seis genes utilizando la amplificación por PCR. Los datos del experimento de transformación del pepino se enumeraron en la Tabla complementaria S1. En total, obtuvimos solo una línea de pepino transgénico independiente después de la transformación con el vector U22p-SCE. Aunque la frecuencia de transformación fue relativamente baja en este estudio, este es el primer estudio en el que 6 genes se transformaron simultáneamente en el genoma del pepino, y una transformación de vector grande es impredecible. Estudios previos han sugerido que la eficiencia de transformación genética del pepino aún es muy variable y que los genotipos de explantes que se pueden usar son limitados. Para mejorar la eficiencia de la transformación con un vector multigénico en un sistema mediado por Agrobacterium, aún es necesario optimizar el paso esencial en la transformación genética, que son las tareas clave y los objetivos para la siguiente etapa. Además, medimos el nivel de expresión de los transgenes a través de qRT-PCR (Fig. 2d). El análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) reveló que los niveles de transcripción de SgSQE1, SgCS, SgEPH2, SgP450, SgUGT269-1 y SgUGT289-3 fueron notablemente más altos en las plantas WT. En este ensayo, la expresión de 6 transgenes varió en las hojas y frutos. Por ejemplo, en los seis transgenes, la expresión de SgSQE relativamente más baja se detectó tanto en las hojas como en los frutos (Fig. 2d), que se ubicó en la segunda posición del gen para la construcción de péptidos 2A impulsada por el promotor CaMV 35S (Fig. S2a complementaria). ). El nivel de expresión génica entre la primera y la segunda posición génica se vio comúnmente afectado por la utilización de diferentes péptidos 2A43. En general, la detección por PCR y qRT-PCR indicó que los genes estructurales involucrados en la biosíntesis de mogrosides se expresaron en las líneas transgénicas de pepino. Finalmente, solo la planta transgénica U1 se adquirió mediante transformación mediada por Agrobacterium.

a Transformación genética de pepino con Agrobacterium que alberga el vector U22p-SCE. (1) Semillas esterilizadas. (2) plántulas de 4 días de edad. (3) Los cotiledones se cortaron y utilizaron como explantes. (4) Los explantes en el medio seleccionado. (5) Las plantas regeneradas en los medios de enraizamiento. (6, 7) Plantas regeneradas. b Hojas y frutos de pepino transgénico línea U1. c Detección de U1 basada en PCR. Los carriles de izquierda a derecha representan Maker, WT, frutos U1 y hojas U1. Una imagen del marcador de ADN (4,5 kb) se encuentra en la esquina inferior derecha de la figura. d Análisis del nivel de transcripción de la línea U1 de pepino transgénico según qRT-PCR. La Csactina se utiliza como control interno. La expresión de plantas WT de pepino se fijó en 1. Los datos se presentan como valores medios ± DE, n = 3 muestras biológicamente independientes.

Sobre la base de un análisis molecular, la composición y el contenido de mogrosides en la línea de pepino transgénico se determinaron mediante HPLC-ESI-MS/MS. Los estándares Mogrol, MI-A1, MII-E, MIII, SI y MV se detectaron en tiempos de retención de 4.01, 19.38, 13.88, 12.03, 10.14 y .8.37 min, respectivamente (Fig. 3a y Fig. S4a complementaria). Como se muestra en la Fig. 3b y la Fig. S4b complementaria, se detectaron mogrol, MIA-1, MII-E, MIII y SI en frutos y hojas de pepino transgénico, excepto MV, que se encontró solo en los frutos. MV acumulado a ~ 587 ng / g de peso fresco (FW) en las frutas, y el contenido de los otros mogrosides se enumera en la Fig. 3b y la Fig. S4b complementaria. No se detectaron mogrosides en las plantas de pepino WT. Además, los metabolitos se identificaron más mediante UPLC-ESI-QTOF-MS/MS, y los cromatógrafos de iones totales en modo negativo se muestran en la Fig. 4. De acuerdo con el tiempo de retención, el peso molecular real y la espectrometría de masas de los estándares, cinco mogrosidos se observaron en frutos transgénicos de pepino U1, incluidos MI-A1, MII-E, MIII, SI y MV. Y [M + HCOO-H]- y [MH]- se observaron comúnmente en el espectro MS/MS en modo de iones negativos. El modo de fractura de MV fue el siguiente: los fragmentos característicos obtuvieron fácilmente una molécula de ácido fórmico, lo que resultó en iones de producto a m/z 1331,5443 en el espectro de MS. Los iones desprotonados de [MH]- (m/z 1285,5507) se observaron claramente en el espectro MS/MS (Fig. S5a complementaria). Además, SI obtuvo una molécula de ácido fórmico para mostrar [M + HCOO-H]- (m/z 1169.5096) y generó un ion desprotonado [MH]- en m/z 1123.5330 (Fig. S5b complementaria). De manera similar, según los espectros de MS/MS, los compuestos 3, 4 y 5 se identificaron como MIII, MII-E y MI-A1 (Figura complementaria S5c-e). En particular, la presencia de mogrosides confirmó que la expresión simultánea de los 6 genes fue exitosa en la línea de pepino transgénico. El pepino dulce se generó con éxito mediante la reconstrucción de la biosíntesis de mogrosides en pepino transgénico. Interesante, en la licencia U1, la presencia de mogrosides también demostró ser un gran potencial para la producción de SI utilizando desechos agrícolas. En nuestro estudio, desarrollamos una estrategia de transformación multigénica conveniente y altamente eficiente a través de la tecnología In-fusion y los conectores peptídicos 2A. Estos resultados indican que esta estrategia podría aplicarse en pepino y tener implicaciones importantes para el desarrollo de vegetales que acumulan mogrosides en primer lugar.

un análisis HPLC-ESI-MS/MS de mogrosides en la línea U1 de pepino transgénico. Las flechas negras indican el pico de mogrosides. b Acumulación de mogrosides en pepino transgénico línea U1. nd, no detectado. Los datos se presentan como valores medios ± DE, n = 3 muestras biológicamente independientes.

MIA-1, MII-E, MIII, SI y MV representaron el mogroside I-A1, mogroside II-E, mogroside III, siamenoside I y mogroside V, respectivamente.

De manera similar, el vector multigénico se transformó en tomate Micro-Tom. Se transformaron alrededor de 500 explantes en el ensayo y se generaron veinte líneas transgénicas de tomate resistentes a Hyg mediante múltiples métodos de transformación. Entre ellos, solo cuatro líneas tenían genes relacionados con la biosíntesis de mogrosidos detectados mediante PCR con cebadores específicos para los genes SgSQE1, SgCS, SgEPH2, SgP450, SgUGT269-1, SgUGT289-3 e Hyg. Se obtuvieron fragmentos del tamaño esperado a partir del ADN genómico de cuatro líneas candidatas de tomate transgénico. Todos los genes relacionados con la biosíntesis de mogrosides se amplificaron a partir de estas cuatro líneas (S8, S10, S14 y S17) de las veinte líneas transformadas con el vector U22p-SCE (Fig. 5a); ninguno de los genes objetivo se observó en las plantas WT (Fig. 5b). Es decir, este vector multigénico se introdujo con éxito en el genoma del tomate. Para confirmar aún más las líneas transgénicas, se examinó el nivel de expresión de los genes objetivo en las líneas S8, S10, S14 y S17 mediante qPCR (Fig. 5c). Todos los genes relacionados con la biosíntesis de mogrosides se sobreexpresaron, aunque hubo niveles de expresión relativamente más altos de todos los genes en la línea S10 (Fig. 5c). No se detectaron transcripciones de los genes diana en las plantas de tomate WT, lo que indica que 6 genes estructurales implicados en la biosíntesis de mogrosides se expresaron en frutos de tomate transgénicos. Es decir, la ruta de los mogrosidos se introdujo con éxito en las plantas de tomate transgénicas en primer lugar.

a Plantas de tomate de tipo salvaje (WT) Micro-Tom y plantas de tomate transgénicas. b Análisis basado en PCR de los frutos de tomate transgénicos. Los carriles de izquierda a derecha representan Maker, WT, S8, S10, S14 y S17. Una imagen del marcador de ADN (4,5 kb) se encuentra en la esquina inferior derecha de la figura. c Análisis del nivel de expresión relativa de 6 genes de biosíntesis de mogrosides en frutos de tomate transgénicos. El Leactin se utiliza como control interno. La expresión de plantas de tomate WT se fijó en 1. Los datos se presentan como valores medios ± DE, n = 3 muestras biológicamente independientes.

La producción de mogrosides en los cuatro frutos de tomate transgénicos se midió por HPLC-ESI-MS/MS. El cromatograma de iones extraídos (EIC) de HPLC sugirió que se acumuló una pequeña cantidad de MIII en la línea de tomate transgénico S10 (Fig. 6a), y los tiempos de retención fueron consistentes con los de los estándares de mogrosides. No se detectó MIII en las plantas WT (Fig. 6a). El contenido de MIII fue de 25,92 ng/g FW (Fig. 6b), y también encontramos una pequeña cantidad de MI-A1 (5,65 ng/g), MII-E (2,33 ng/g), SI y MV. Sin embargo, el contenido de SI y MV todavía está por debajo del límite de cuantificación (

un análisis HPLC-ESI-MS/MS de mogrosides en frutos de tomate transgénicos. b Acumulación de MIII en frutos de tomate transgénico. Las flechas negras indican el pico de mogrosides. nd, no detectado. Los datos se presentan como valores medios ± DE, n = 3 muestras biológicamente independientes.

El pepino es una verdura comúnmente nutritiva, pero tiene un sabor suave. Los compuestos polifenólicos y las proteínas salivales proporcionan a los pepinos un sutil sabor astringente, lo que hace que algunas personas eviten comer pepinos44,45. Para mejorar el sabor del pepino, los genes de biosíntesis de mogrosides de Siraitia grosvenorii se transformaron en plantas de pepino, lo que produce un germoplasma con mogroside V. Y en los frutos de la línea transgénica de pepino U1, mogrol, MI-A, MII-E, MIII y SI y los contenidos fueron 36,88, 58, 74,3, 615 y 113 ng/g FW, respectivamente. Aunque es bien sabido que el mogroside IA-1, II-E son glucósidos de sabor amargo, SI y MV son extremadamente dulces, MIII es insípido o ligeramente dulce, que cultiva pepinos para tener un sabor dulce, mezclar sabores o sabores totalmente nuevos para comúnmente hortalizas conocidas. Y el contenido de MI-A y MII-E con sabor amargo estaba presente en un nivel demasiado bajo en los frutos de pepino transgénico y, por lo tanto, la consecuencia para el sabor del pepino transgénico es relativamente pequeña. De manera similar, la transformación de tomate produjo una pequeña cantidad de mogroside III en tomate. El contenido de SI y MV aún está por debajo del límite de cuantificación (

En nuestro estudio, los resultados de la observación morfológica de las plantas de tomate transgénicas revelaron que se observaron enanos graves en las cuatro líneas transgénicas de tomate independientes, pero no se encontraron cambios morfológicos evidentes en las plantas de pepino transgénicas. Este resultado sugiere que los mogrosidos pueden afectar el crecimiento de las plantas, lo que puede producir efectos metabólicos tóxicos en las líneas de tomate transgénico. La posible explicación de la ausencia de enanismo en el pepino es que tanto el pepino como Siraitia grosvenorii son plantas cucurbitáceas, y en el propio pepino hay muchas saponinas triterpénicas cucurbitánicas como la cucurbitacina B y la cucurbitacina C, y los mogrosidos también son saponinas triterpénicas, en este caso, no hay efecto de toxicidad en las líneas de pepino transgénico. Además, de acuerdo con las investigaciones previas, la mayoría de los estudios han demostrado que la ingeniería transgénica ha provocado una alteración metabólica en el metabolismo de las giberelinas, lo que conduce al enanismo en las líneas transgénicas de tomate52,53. Y la inserción de genes transgénicos a menudo provoca un crecimiento deficiente, enanismo grave en plantas transgénicas, por ejemplo, un estudio previo mostró que la integración de T-DNA en el genoma activará o inactivará la expresión de otros genes no específicos, lo que ha causado trastornos fisiológicos o resistencia de la planta. en plantas transgénicas54,55. Por lo tanto, especulamos que el enano del tomate transgénico en este estudio puede estar correlacionado con los cambios en el metabolismo de la giberelina, pero se introducirá más información en varios experimentos futuros.

La transformación multigénica se puede utilizar para introducir vías metabólicas completas en las plantas. A diferencia de los pasos tediosos y que consumen mucho tiempo de los métodos convencionales de cruzamiento, retransformación y cotransformación56,57, la transformación de vectores multigénicos emergentes y los transgenes policistrónicos tienen excelentes ventajas. En particular, la transformación de múltiples vectores permite el ensamblaje de múltiples casetes de expresión génica en una sola región de ADN-T y la integración en el genoma del cromosoma huésped57,58. Hasta la fecha, no hay evidencia que sugiera que se pueda introducir la cantidad máxima de transgenes en las plantas y, sin embargo, se han realizado pocas investigaciones sobre 6 o más transformaciones de transgenes en un solo vector. Además, a medida que aumenta el número de transgenes, los vectores binarios inestables pueden inducir la pérdida espontánea de genes en plantas heterólogas59,60. En consecuencia, el diseño esquemático del conjunto de vectores multigénicos en esta investigación fue importante. El sistema Transgene Stacking II (TGS II)61,62, el sistema Gateway Recombination63,64, el Gibson Assembly65,66 y la tecnología In-fusion67 se han utilizado ampliamente en el ensamblaje de vectores multigénicos. Entre estos, el sistema de recombinación Gateway sigue siendo un desafío con respecto al ensamblaje de más de cinco genes debido a la dificultad operativa. Sobre esta base, TGS II se desarrolló recientemente como un sistema de vector multigénico más conveniente y eficiente que puede usarse para transformar 4–8 genes en plantas heterólogas68. La tecnología de ensamblaje e infusión de Gibson se ha utilizado ampliamente para fusionar múltiples fragmentos de ADN superpuestos simultáneamente en una sola reacción. Además, el tamaño máximo de vector de la tecnología In-fusion es de 46 kb. Por lo tanto, la tecnología In-fusion permite el ensamblaje de múltiples casetes de expresión génica. Teniendo en cuenta las secuencias repetitivas en un vector multigénico, se introdujeron péptidos 2A autoescindibles (de 16 a 20 aminoácidos), que conducen a niveles relativamente altos de expresión de proteínas aguas abajo en comparación con otras estrategias para la expresión multigénica69,70,71. Sin embargo, la eficiencia de la expresión de proteínas está mediada por diferentes secuencias 2A. En este estudio, los niveles de transcripción de SgSQE1, SgCS, SgEPH2, SgP450, SgUGT269-1 y SgUGT289-3 fueron diferentes en las hojas y frutos de pepino transgénico. Una posible razón es que la mayoría de los transgenes están impulsados ​​por un promotor constitutivo, el promotor CaMV 35S, que mostró variaciones marcadas en la actividad transcripcional según el tipo de tejido y órgano72,73,74,75,76. El promotor CaMV 35S impulsó la actividad de la β-glucuronidasa (GUS) fue mayor en las raíces de abedul y las yemas axilares que en otros órganos del abedul75. La proteína de fluorescencia verde (GFP) impulsada por el promotor CaMV 35S tuvo una mayor actividad en los tejidos vasculares de la hoja de tabaco que en otros tejidos74. Y las condiciones fisiológicas y el estrés abiótico también afectaron la expresión de los transgenes objetivo. Por lo tanto, para asegurar una actividad transgénica alta y estable, se debe prestar una atención considerable a la construcción del vector multigénico ya las condiciones de crecimiento.

En resumen, se desarrolló una estrategia de apilamiento de genes basada en la fusión para el apilamiento de transgenes, se transfirieron 6 genes de biosíntesis de mogrosides a pepino y tomate, y pepino dulce transgénico que contenía mogroside V y tomate ligeramente dulce que contenía mogroside III. Este estudio muestra el gran potencial en la mejora genética de las plantas dulces de consumo fresco. Nuestro trabajo cambia fundamentalmente el patrón tradicional de mejoramiento de sabor dulce y ofrece un modo excelente para la transformación de componentes dulces sin azúcar y sin proteínas en lugar de aumentar los contenidos de azúcar en vegetales frescos. Además, este estudio proporciona una posibilidad para la biosíntesis heteróloga de mogrosides.

Cucumis sativus (JinYan 4, ZY4) y Lycopersicon esculentum (Micro-Tom) se utilizaron para la transformación de plantas. Se llevaron a cabo experimentos de expresión transitoria en Cucumis sativus ZY4 y tabaco. En este experimento se usaron las cepas de Escherichia coli DH5α y XL10-Gold (WeidiBio, Shanghái, China), y la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens se usó para la transformación.

Los promotores apropiados son cruciales para impulsar la expresión de genes diana en vectores multigénicos. Los promotores de ubiquitina 10 AtUBQ10 y serina carboxipeptidasa similar a AtSCPL30 (AtPD7, 456 pb) se clonaron de Arabidopsis thaliana utilizando KOD One PCR Master Mix (TOYOBO CO., LTD., Japón). Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: activación inicial a 98 °C durante 5 min, seguida de 35 ciclos a 98 °C durante 10 s, temperatura de recocido −5 °C durante 5 s y 68 °C durante 10 s/kb, y una extensión final a 68 °C por 7 min. Para construir los vectores AtUBQ10:β-glucuronidasa (GUS) y AtPD7:GUS, cada uno de estos promotores se fusionó con un plásmido pBI121 en los sitios de restricción XbaI/BamHI (Fig. 1b). Los cebadores se enumeraron en la Tabla complementaria S2. Los plásmidos recombinantes resultantes se confirmaron mediante secuenciación. pBI121 impulsado por el promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV 35S) se utilizó en este estudio como control positivo. Todos los plásmidos se transformaron en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens y se usaron para ensayos transitorios en Cucumis sativus y Nicotiana benthamiana.

El ADNc de frutos de Siraitia grosvenorii se utilizó para amplificar las secuencias codificantes de SgSQE1 (escualeno epoxidasa), SgCS (cucurbitadienol sintasa), SgEPH2 (epóxido hidrolasas), SgP450 (citocromo P450 monooxigenasa), SgUGT269-1 y SgUGT289-3 (UDP-glucosiltransferasas). )29. Para iniciar la expresión de todos los genes, el promotor CaMV 35S se aisló del plásmido pBI121, y los promotores AtUBQ10 y AtPD7 se amplificaron de Arabidopsis thaliana usando KOD One PCR master Mix. En términos de terminadores transcripcionales, los terminadores de nopalina sintasa (NOS) se obtuvieron de pBI121, y los terminadores de manopina sintasa (MAS) y los terminadores de proteína de choque térmico (HSP) 18.2 fueron sintetizados químicamente por GENEWIZ (Suzhou, China).

En la primera ronda de ensamblaje de genes, cada uno de estos genes relacionados con la biosíntesis de mogrosides se amplificó a través de Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China), y luego SgCS, SgEPH2, SgP450 y SgUGT289- 3 se ligaron en los sitios BamHI y SacI del vector pBI121 utilizando un kit de clonación de un solo paso ClonExpress II (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China). SgSQE1 se fusionó con el promotor AtPD7 y el terminador HSP, y se insertó SgUgt269-1 junto con el promotor AtUBQ10 y el terminador MAS en pBI121 en los sitios HindIII y EcoRI utilizando un kit de clonación ClonExpress MultiS One Step (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, China), respectivamente. Se generaron PD7:SgSQE1:Thsp, 35S:SgCS:Tnos, 35S:SgEPH2:Tnos, 35S:SgP450:Tnos, 35S:SgUGT289-3:Tnos y UBQ10:SgUGT269-1:Tmas. En la segunda ronda de ensamblaje de genes, cada uno de los primeros casetes de expresión génica que contenían el promotor, el gen diana y el terminador se clonó a través de KOD One PCR Master Mix. PD7:SgSQE1:Thsp y 35S:SgCS:Tnos se insertaron en los sitios de restricción EcoRI/HindIII de un plásmido binario pCAMBIA1300 mediante un kit de clonación ClonExpress MultiS One Step. De manera similar, UBQ:SgUGT269-1:Tmas y 35S::SgUGT289-3:Tnos se ligaron en los mismos sitios de restricción del plásmido pCAMBIA1300, produciendo un casete de expresión de doble gen. En la tercera ronda de ensamblaje de genes, las regiones de PD7:SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos y 35S:SgEPH2:Tnos se amplificaron mediante PCR y se subclonaron en UBQ10:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289- 3: sitios Tnos EcoRI/HindIII de un plásmido pCAMBIA1300. Luego, las secuencias de UBQ10:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos y 35S:SgP450:Tnos fueron aisladas e insertadas en el plásmido pCAMBIA1300 y se construyeron casetes de expresión de triple gen. Posteriormente, en la ronda final de ensamblaje de genes, la secuencia de 6,1 kb de UBQ10:SgUGT269-1:Tmas::35S:SgUGT289-3:Tnos::35S:SgP450 y SgSQE1:Thsp::35S:SgCS:Tnos:: Se aislaron 35S:SgEPH2:Tnos (6,5 kb) de los casetes de expresión de genes triples. Para el vector de expresión multigénica final, los fragmentos mencionados anteriormente se ligaron con un conector peptídico 2A de teschovirus porcino (la secuencia de aminoácidos es GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP) (P2A) a través de un kit de clonación ClonExpress Ultra One Step (Vazyme Biotech Co., Ltd., Nanjing, Porcelana). Este vector final se denominó vector U22p-SCE en este estudio (Fig. S2a complementaria). Todos los cebadores utilizados para la construcción de vectores multigénicos se enumeran en la Tabla complementaria S3.

Para verificar los vectores de expresión multigénica y analizar la actividad del promotor, se realizó un ensayo de expresión transitoria en Cucumis sativus ZY4 y tabaco. Se transformó un vector de expresión multigénica en la cepa GV3101 de Agrobacterium tumefaciens mediante el método de congelación-descongelación. Las cepas de Agrobacterium transformadas se cultivaron a 28 °C en medio LB suplementado con rifampicina y kanamicina hasta que la DO600 de la bacteria alcanzó 0,6. Todos los cultivos se centrifugaron a 5000 × g durante 10 min, se resuspendieron en un tampón que incluía ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES) 10 mM, MgSO4 10 mM y acetosiringona (AS) 200 μM, y luego se incubaron durante 2– 4 horas a temperatura ambiente. La suspensión se infectó mediante una jeringa sin aguja en cotiledones de plantas Cucumis sativus ZY4 de 8 días de edad y hojas de Nicotiana benthamiana (control positivo). Para garantizar la precisión, los procedimientos de expresión transitoria se repitieron de forma independiente diez veces.

Se tomaron muestras de Nicotiana benthamiana a las 48 h después de la infiltración, y se tomaron muestras de cotiledones de Cucumis sativus ZY4 a los días 1, 3, 5 y 7 para análisis de tinción histoquímica GUS de acuerdo con un protocolo previo42. Las imágenes fueron tomadas con una Canon EOS 80D. Las imágenes se usaron para determinar la intensidad de la tinción azul. Este experimento se repitió de forma independiente diez veces.

Las semillas de Cucumis sativus línea ZY4 se sumergieron a 55 °C durante 15 min y luego se colocaron a temperatura ambiente durante 2 h. Las semillas de pepino se esterilizaron siguiendo a Trulson et al. con modificaciones menores77. Después del remojo, las semillas se esterilizaron con alcohol al 75 % durante 30 s, seguido de NaClO al 3 % durante 15 min, luego se lavaron 5 veces con agua estéril y se inocularon en Murashige y Skoog (MS) en oscuridad durante 3 d. Para obtener pepino genéticamente modificado, utilizamos como explantes los cotiledones de Cucumis sativus (pepino) de 4 días de edad. Se cortaron los cotiledones de las plántulas y se eliminó el punto de crecimiento. Los explantes se colocaron en los medios de precultivo, medios MS que contenían 1 mg/L de 6-bencilaminopurina (6-BA), 0,5 mg/L de ácido abscísico (ABA) y 2 mg/L de AgNO3 durante 1 día en la oscuridad. Luego, los explantes se infectaron con Agrobacterium que albergaba el vector de expresión multigénica durante 30 min. y se cocultivaron en medios de cocultivo (medios MS con 1 mg/L de 6-BA, 0,5 mg/L de ABA, 2 mg/L de AgNO3 y 1,45 mg/L de AS) durante 2 días en la oscuridad a 25 °C. Después de los cocultivos, los explantes se cultivaron en medio selectivo (medio MS con 1 mg/L de 6-BA, 0,5 mg/L de ABA, 2 mg/L de AgNO3, 500 mg/L de Cefotaxima sódica (Cef) y 5 u 8 mg de /L de higromicina (Hyg) en condiciones de 18 h de luz/6 h de oscuridad). Se usó Hyg (5 mg/L) para seleccionar las plantas transformadas. Calli creció en medios MS suplementados con Hyg (8 mg/L). Generalmente, los brotes adventicios que surgieron de los callos alcanzados se regeneraron en explantes verdes y saludables. Luego, se seleccionaron segmentos de 2–3 cm de los regenerantes para cultivo en medios de enraizamiento suplementados con 10 mg/L de Hyg. Después de 1 mes de cultivo, las plántulas de pepino regeneradas se cortaron in vivo y luego se cultivaron en un invernadero (Fig. 2a). Después de eso, las plantas de callo y regeneración se obtuvieron por subcultivo continuo. Para obtener líneas transgénicas, las plantas de regeneración se cultivaron en medios de enraizamiento (medios MS con 1 mg/l de giberelina A3 (GA3), 400 mg/l de Cef). Las plantas regeneradas se cultivaron en un invernadero a 28 °C durante 18 h/6 h (luz/oscuridad).

La transformación genética se realizó siguiendo a Sun et al. con modificación78. Las semillas de Micro-Tom se esterilizaron en etanol al 70 % durante 30 s y en NaClO al 10 % durante 10 min, se enjuagaron cuatro veces con agua esterilizada y se secaron sobre papel de filtro esterilizado. Las semillas se germinaron en medio MS. Usando hojas, cotiledones e hipocótilos de plantas Micro-Tom de 10 días de edad como explantes, se cortaron hojas y cotiledones en trozos de aproximadamente 0,5 cm × 0,5 cm, los hipocótilos se cortaron en segmentos de aproximadamente 0,5-0,6 cm para permitirles adsorber la suspensión bacteriana. Se precultivaron en los medios de precultivo (medios MS con 1 mg/l de 6-BA y 0,2 mg/l de NAA) durante 24 h. Después del precultivo, los explantes se incubaron durante 30 minutos con Agrobacterium que albergaba el vector de expresión multigénica y luego se transfirieron a medios de cocultivo (medios MS que contenían 1 mg/L de 6-BA, 0,2 mg/L de NAA y 0,1 mM de AS) para 2 días. Luego, los explantes se transfirieron a medios de selección (2,0 mg/L de zeatina (ZT), 0,2 mg/L de ácido indolacético (IAA), 10 mg/L de Hyg y 500 mg/L de carbenicilina). Posteriormente, los brotes se transfirieron a medios de elongación (1,0 mg/L ZT, 0,05 mg/L IAA, 500 mg/L Cef, 10 mg/L Hyg y 500 mg/L carbenicilina), y los brotes regenerados se dejaron crecer hasta una longitud de 1 cm. Posteriormente, los brotes se transfirieron a medios de cultivo de enraizamiento que consistían en medios MS de 1/2 potencia con 0,1 mg/L de IAA, 2 mg/L de Hyg, 500 mg/L de Cef y 500 mg/L de carbenicilina.

El ADN genómico se obtuvo de las líneas transgénicas usando un Plant Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Co., Ltd., Beijing). Se realizó una PCR genómica con KOD One PCR Master Mix para verificar las plantas transgénicas. Además, se utilizó la PCR genómica para detectar las líneas transgénicas obtenidas mediante el cribado de resistencia Hyg. Se usó ADN genómico de plantas de tipo salvaje (WT) como control negativo. Todos los cebadores utilizados para la detección por PCR se muestran en la Tabla complementaria S4.

El ARN total se aisló de las hojas de las plantas transgénicas a través de un kit de extracción de ARN CWBIO (CWBIO. Co., Ltd., Beijing, China), y se usó 1 μg de ARN total para transcribir inversamente el ADNc a través de TransScript® One-Step gDNA. Remoción y Síntesis de ADNc SuperMix (Transgen, Beijing, China). Para la PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR), se utilizó PerfectStartTM Green qPCR SuperMix (Transgen, Beijing, China) junto con un ABI CFX96TM Real-Time System (EE. UU.) para cuantificar los niveles de expresión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ciclo térmico fue el siguiente: (1) 95 °C durante 30 s; (2) 40 ciclos de 3 s de desnaturalización a 95 °C, 10 s de hibridación a 55 °C; (3) curva de disociación que consta de 15 s de incubación a 95 °C, 60 s de incubación a 60 °C, una rampa hasta 95 °C. Los niveles de transcripción de genes se cuantificaron con precisión para la expresión del gen objetivo con el método 2-ΔΔCT, y Csactin y Leactin se usaron como control interno. Este experimento se realizó para múltiples repeticiones técnicas. Todos los cebadores utilizados para qRT-PCR se enumeran en la Tabla complementaria S5.

Todas las muestras fueron molidas en nitrógeno líquido (pepino, 10 g y tomate, 4 g), homogeneizadas en 10 mL y 4 mL de solución de metanol al 80%, respectivamente. Y luego se realizó una extracción asistida por baño de agua ultrasónico a temperatura ambiente a 40 kHz durante 1 h, y se centrifugó a 5000 × g durante 20 min. Posteriormente, se recogió el sobrenadante y se filtró con un filtro Millipore de 0,22 µM.

Para el análisis cuantitativo de mogrosides y contenido de mogrol, un sistema AB SCIEX QTRAP 4500 LC-MS/MS (AB SCIEX, Toronto, Canadá) y un sistema LC Agilent Technologies 1260 Series (Agilent, EE. UU.) equipado con una columna Agilent Poroshell 120 SB C18 (100 mm × 2,1 mm, 2,7 µm). La fase móvil constaba de (A) agua (incluido 0,1 % de ácido fórmico) y (B) acetonitrilo (incluido 0,1 % de ácido fórmico) con un gradiente de elución. Las condiciones de HPLC para los mogrosidos fueron las siguientes: 0 min, 20% B; 3–5 min, 23% B; 18 min, 40% B; y 18,01–20,10 min, 20 % B. El caudal fue de 0,25 ml/min. Para mogrol, las condiciones de HPLC fueron las siguientes: 0 min, 20% B; 0,5 min 30% B; 2–4 min, 88% B; y de 5,50 a 8,00 min, 20 % de B. Los parámetros de HPLC-ESI-MS/MS se enumeran en la Tabla 1, y en este estudio se utilizó la ionización por electropulverización (ESI) con monitoreo de reacción múltiple (MRM). Cada experimento se realizó tres veces. Los dos métodos anteriores se han desarrollado para el análisis cuantitativo en nuestro trabajo anterior y son adecuados para la cuantificación precisa de los componentes objetivo en este estudio. Los análisis cuantitativos se realizaron mediante un método estándar externo79,80.

Todos los estándares, incluidos mogroside I-A1 (MI-A1), mogroside II-E (MII-E), mogroside III (MIII), siamenoside I (SI), mogroside V (MV) y mogrol, se adquirieron de Chengdu Must Bio-Technology. Co., Ltd. (Sichuan, China) y se disolvió en metanol.

Para identificar los metabolitos en las plantas transgénicas se analizaron mediante un sistema UPLC-ESI-QTOF-MS/MS (Waters Corp.) con ionización por electropulverización negativa (ESI). Las condiciones de MS estaban en modo continuo MSE, con un rango de exploración de m/z 100 a 1500. El voltaje de colisión fue de 2,5 KV. El voltaje del cono de muestreo y el voltaje del extractor fueron de 40 KV y 4 KV, respectivamente. La temperatura de origen y la temperatura de desolvatación fueron 100 °C y 250 °C, respectivamente. El flujo de gas del cono fue de 50 l/h y el flujo de gas de desolvatación fue de 600 l/h; La energía de colisión se aumentó de 15 a 45 eV para la recopilación de datos MS/MS. Se utilizó el software Masslynx 4.1 para la adquisición y procesamiento de datos.

Los datos del análisis cuantitativo en tiempo real se presentan como la media ± SEM de al menos tres experimentos independientes en el documento. A menos que se indique lo contrario, todas las muestras se obtuvieron aleatoriamente y todas las muestras o experimentos independientes se repitieron más de tres veces. Los valores promedio y las desviaciones estándar se calcularon utilizando el programa estadístico SPSS 16.0 (IBM Co., Armonk, Nueva York, EE. UU.). Todas las parcelas se obtuvieron utilizando Origin 2019b (OriginLab Co., Northampton, MA, EE. UU.).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las imágenes de transferencia sin procesar se muestran en la figura complementaria S7. Los datos de origen de las figuras están disponibles en Datos complementarios 1. Este plásmido Up-SCE está disponible a través del catálogo de Addgene n.º 197269. Todos los demás datos relevantes están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (U20A2004; 81973413; 82104548), el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (CIFMS) (2019-1007-15; 2021-I2M-1-071), y el Science y Proyecto Principal de Tecnología de Guangxi (GuiKeAA19254025).

Jing Jing Liao

Dirección actual: The Artemisinin Research Center, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing, 100700, China

Instituto de Desarrollo de Plantas Medicinales, Academia China de Ciencias Médicas y Facultad de Medicina de la Unión de Pekín, Pekín, 100193, China

Jingjing Liao, Lei Xie, Jing Qiao, Shengrong Cui, Xunli Jia, Zuliang Luo y Xiaojun Ma

Facultad de Horticultura, Universidad Agrícola de Shenyang, Shenyang, 110866, China

tingyao liu

Laboratorio de Biotecnología y Mejoramiento Genético de Cultivos de Guangxi, Academia de Ciencias Agrícolas de Guangxi, Nanning, 530007, China

Changming Mo

Laboratorio clave de fitoquímicos funcionales de plantas y utilización sostenible de Guangxi, Instituto de Botánica de Guangxi, Región Autónoma de Guangxi Zhuang y Academia de Ciencias de China, Guilin, 541006, China

Xiyanghuang

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JL, XM y JQ concibieron este estudio. Vector multigénico construido por JL, TL y LX. JL, CM y XH realizaron el ensayo de transformación de plantas. SC, JL y XJ realizaron la detección por PCR y el análisis qRT-PCR. ZL detectó los componentes mogrosides en las plantas transgénicas. XM supervisó el proyecto. JL redactó el manuscrito. XM, ZL y TL revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Zuliang Luo o Xiaojun Ma.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Oswaldo Hernandez-Hernandez, Ana Muñoz y Yoshihiko Nanasato por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Leena Tripathi y Joao Valente. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Liao, J., Liu, T., Xie, L. et al. Biosíntesis de mogrosidos heterólogos en pepino y tomate mediante manipulación genética. Comun Biol 6, 191 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04553-3

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Recibido: 22 mayo 2022

Aceptado: 03 febrero 2023

Publicado: 17 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04553-3

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