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Jun 13, 2023

El carboxilato de ciclodextrina mejora la estabilidad y la actividad de la nisina en una gama más amplia de condiciones de aplicación

npj ciencia de los alimentos volumen 7,

npj Science of Food volumen 7, Número de artículo: 20 (2023) Citar este artículo

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La nisina es una bacteriocina natural que exhibe una buena actividad antibacteriana contra las bacterias Gram-positivas. Tiene buena solubilidad, estabilidad y actividad en condiciones ácidas, pero se vuelve menos soluble, estable y activo cuando el pH de la solución excede 6,0, lo que restringe severamente el rango de aplicación industrial de la nisina como agente antibacteriano. En este estudio, investigamos el potencial de complejar la nisina con un carboxilato de ciclodextrina, ácido succínico-β-ciclodextrina (SACD), para superar las desventajas. Se demostró un fuerte enlace de hidrógeno entre la nisina y el SACD, lo que promovió la formación de complejos de nisina-SACD. Estos complejos exhibieron buena solubilidad en condiciones neutras y alcalinas, y buena estabilidad después de mantenerse a altos valores de pH durante el procesamiento con esterilización con alto contenido de vapor. Además, los complejos de nisina-SACD mostraron una actividad antibacteriana significativamente mejorada contra bacterias Gram-positivas modelo (S. aureus). Este estudio muestra que la complejación puede mejorar la eficacia de la nisina en situaciones neutras y alcalinas, lo que puede ampliar en gran medida su rango de aplicación en las industrias alimentaria, médica y otras.

La nisina es un pequeño péptido compuesto por 34 residuos de aminoácidos producido por la cepa de la subespecie Lactococcus lactis, que es la única bacteriocina aprobada como conservante de alimentos1. Generalmente se reconoce como seguro (GRAS) y se usa ampliamente en las industrias de alimentos, medicinas y agricultura. La nisina muestra actividad antibacteriana de amplio espectro contra bacterias Gram-positivas. Se cree que se adsorbe en las membranas celulares de las bacterias, las altera y hace que se liberen sustancias celulares internas, lo que promueve la muerte celular2,3. En condiciones ácidas (pH < 6,0), la nisina muestra una solubilidad y estabilidad deseables con solo una ligera pérdida de actividad después del tratamiento térmico4,5. Sin embargo, la estructura de la nisina cambia en condiciones alcalinas debido a una reacción de adición nucleófila intermolecular, que da como resultado una disminución de la solubilidad en agua, la estabilidad térmica y la actividad antibacteriana6,7. Por lo tanto, la aplicación industrial de la nisina como antimicrobiano natural actualmente se limita a condiciones ácidas.

El pH de la mayoría de los fluidos fisiológicos está en el rango de 6,0 a 8,5, incluidos los fluidos intracelulares, extracelulares e intestinales8. Para ampliar las aplicaciones industriales de la nisina, se han dedicado esfuerzos a identificar estrategias para mantener su solubilidad, estabilidad y actividad antibacteriana en situaciones fisiológicas. Los ácidos orgánicos pueden asociarse con la nisina en soluciones acuosas a través de enlaces de hidrógeno, lo que puede aumentar el rendimiento de la nisina. Por ejemplo, Adhikari et al. 7 mostró que un compuesto de nisina-ácido orgánico tenía una actividad antimicrobiana mucho mayor a pH 8,0 que la nisina pura. También se ha demostrado que el uso de una combinación de nisina con EDTA aumenta la actividad antibacteriana de nisin9, que se atribuyó a la capacidad del agente quelante para aumentar la permeabilidad de las paredes celulares bacterianas. Sin embargo, no hubo una mejora evidente en la estabilidad de la nisina. Otros esfuerzos que pretenden mejorar la estabilidad de la nisina generalmente se basan en sistemas de nanoadministración preparados a partir de biopolímeros, como quitosano, celulosa y pectina3,10,11. Sin embargo, la construcción de estos sistemas de entrega a menudo es complicada, costosa y difícil de ampliar, lo que limita su aplicación industrial. En consecuencia, sería ventajoso desarrollar un método simple y barato que pudiera cumplir con los requisitos industriales prácticos.

Las ciclodextrinas (CD) son oligosacáridos cíclicos compuestos por varios números de unidades de α-D-glucopiranosa, que se producen a partir del almidón por hidrólisis enzimática y están autorizados para su uso en alimentos y productos para la salud en la mayoría de las regiones del mundo12. La naturaleza cíclica de las CD conduce a la creación de moléculas que tienen un núcleo hidrófobo y un exterior hidrófilo, lo que las hace adecuadas como moléculas anfitrionas para incorporar moléculas o restos no polares13. La encapsulación de compuestos bioactivos en CD a menudo mejora su dispersabilidad en agua, mejora su resistencia al calor, la luz y el oxígeno, y permite una liberación controlada14,15. Anteriormente, los investigadores demostraron que la encapsulación de nisina dentro de β-CD mejoró su actividad antibacteriana durante la conservación de la carne de cerdo cocida16, lo que se atribuyó a la formación de complejos de nisina-CD que cambiaron el microambiente de la nisina. Sin embargo, todavía existe la necesidad de una forma alternativa de CD que pueda mejorar la solubilidad, la estabilidad y la actividad antimicrobiana de la nisina al mismo tiempo.

β-CD muestra bajo costo y fuerte afinidad de unión a sustancias huésped hidrofóbicas entre las ciclodextrinas comúnmente utilizadas en la industria alimentaria. Sin embargo, su solubilidad en agua (alrededor de 1,85%) es insuficiente para muchas aplicaciones comerciales17. Por lo tanto, la dosis de β-CD utilizada para mejorar la solubilidad de la nisina estaba restringida en los sistemas prácticos. Derivados de β-CD ampliamente utilizados en aplicaciones farmacéuticas comerciales, incluidos hidroxipropil-β-CD (HP-β-CD), sulfobutiléter-β-CD (SBE-β-CD) y metil-β-CD (M-β-CD ) muestran una dispersión del agua muy mejorada después de la modificación química17,18. También se están explorando nuevas estrategias para crear derivados de ciclodextrina de calidad alimentaria. Por ejemplo, los anhídridos succínicos de octenilo y octadecenilo se han unido a los grupos hidroxilo de las moléculas de ciclodextrina para producir derivados con buenas propiedades emulsionantes19,20. Sin embargo, estos grandes sustituyentes de β-CD pueden afectar su capacidad para incorporar moléculas huésped debido a los efectos de impedimento estérico. En nuestro estudio anterior, se obtuvo un derivado de ciclodextrina, ácido succínico-β-ciclodextrina (SACD) y se demostró que es 50 veces más dispersable en agua que β-CD. Mientras tanto, SACD tiene un comportamiento de complejación significativamente mayor a las moléculas huésped21. La modificación siguió un procedimiento de calentamiento en seco químico simple y seguro en el que todos los productos químicos utilizados eran de calidad alimentaria. Se ha demostrado que el SACD obtenido no es citotóxico, lo que podría ser una estrategia prometedora para mejorar la solubilidad y la bioactividad de la nisina.

En este estudio, intentamos mejorar la solubilidad y la actividad antibacteriana de la nisina formando complejos con SACD. Las interacciones moleculares entre nisina y SACD se dilucidaron analizando las estructuras moleculares y cristalinas de los complejos. Se midieron la solubilidad en agua y la estabilidad del complejo nisina-SACD. Además, se elucidó la actividad antibacteriana de los complejos de nisina-SACD contra un patógeno Gram-positivo modelo transmitido por los alimentos (S. aureus.).

Con el fin de revelar las interacciones entre la nisina y el SACD que impulsan la formación de complejos de nisina-SACD, se utilizó el análisis FTIR para comparar las propiedades químicas de la nisina-SACD complejada con nisina, SACD y la mezcla física de nisina y SACD (PM nisina+ SACD) (Fig. 1a). Las interacciones moleculares entre nisina y SACD se ilustraron a partir de los espectros FTIR. El pico ancho de alrededor de 3369 cm−1 se atribuyó a la vibración de estiramiento O–H de las moléculas SACD. El pico de 1732 cm−1 se atribuyó al estiramiento C=O de los enlaces éster de SACD. Las bandas características en 2929, 1155 y 1027 cm−1 se atribuyeron a los grupos CH2, C–O–C y C–OH de SACD, respectivamente. La amplia banda máxima de absorción de la nisina en 3440 cm-1 se atribuyó a las vibraciones de estiramiento axial O-H/N-H, la banda en 2923 cm-1 se atribuyó a la vibración de estiramiento de C-H y la banda alrededor de 1630 cm−1 se atribuyó a la absorción por el grupo amida22. Después de complejarse con SACD, la banda correspondiente a O–H y N–H cambió significativamente a un número de onda más bajo (3269 cm−1), con un cambio de número de onda de −127 y −171 cm−1 en comparación con SACD y nisina, respectivamente. . Mientras tanto, se observó un corrimiento al rojo de 10 cm−1 en la banda del éster C=O para la nisina-SACD a 1722 cm−1. Los fenómenos anteriores indican que se produjeron fuertes enlaces de hidrógeno entre la nisina y la SACD. Presumiblemente, las ramificaciones de ácido succínico en las moléculas SACD desempeñaron un papel importante en estas interacciones. Otros investigadores también han informado de fuertes enlaces de hidrógeno entre componentes similares en complejos23,24. La banda de amida no se observó en el espectro de los complejos de nisina-SACD, lo que puede ser el resultado de los efectos de protección de SACD debido a la proporción relativamente baja de nisina en el complejo. El espectro FTIR de la mezcla física de nisina + SACD fue consistente con una combinación de los dos componentes individuales, sin que se observaran cambios de banda obvios. Estos resultados sugieren que la formación de complejos no se produjo en las mezclas físicas simples de nisina y SACD.

Espectros FTIR (a) y XRD (b) de SACD, nisina, nisina-SACD y mezcla física de nisina y SACD (PM nisina+SACD).

Se sabe que la biodisponibilidad de las sustancias bioactivas está directamente relacionada con la dispersión de las mismas en las matrices. En la industria farmacéutica, la conversión física de las sustancias bioactivas del estado cristalizado al estado amorfo se considera un método eficaz para mejorar la dispersión de las mismas en matrices25. En estudios anteriores, las CD se complejaron con frecuencia con muchos compuestos bioactivos hidrofóbicos, incluidos nutracéuticos y farmacéuticos. Después de la complejación, el estado físico de los compuestos bioactivos pasó de una estructura cristalizada a una forma amorfa con una solubilidad mucho mayor, lo que contribuyó a una biodisponibilidad y bioactividad de los compuestos mejorada de manera efectiva26,27,28. Por lo tanto, la estructura cristalina de la nisina se analizó utilizando un difractómetro de rayos X después de complejarse con SACD en este estudio, para predecir la actividad de los complejos de nisina-SACD. La nisina exhibió picos de difracción en valores de 2θ de 27.4° y 31.7° (Fig. 1b), lo cual es consistente con estudios previos29. No se observaron picos de difracción distintos para SACD, lo que sugiere que SACD tiene una estructura amorfa21. Solo se pudo observar un ligero cambio después de complejar nisina con SACD, lo que sugiere que la nisina existía en forma amorfa en los complejos nisina-SACD. Por lo tanto, especulamos que la naturaleza amorfa de los complejos nisina-SACD aumentaría la actividad biológica de la nisina. Como comparación, la mezcla física de nisina + SACD mostró una combinación simple de patrones de difracción de nisina y SACD, incluidos los picos cristalinos agudos de nisina. Estos resultados indican que la nisina permaneció en forma cristalina en las mezclas físicas, lo que demuestra aún más la formación exitosa de complejos de nisina-SACD.

La complejación de nisina y SACD provoca cambios en el arreglo molecular e interacciones de la nisina, lo que podría afectar su estabilidad térmica. Por lo tanto, se llevó a cabo un análisis termogravimétrico para evaluar el comportamiento de cambio de masa de los complejos y mezclas de nisina-SACD durante el calentamiento controlado. En general, la pérdida de peso de la primera etapa observada por debajo de los 100 °C se atribuyó a la evaporación de la humedad en las muestras. Como se muestra en la Fig. 2a, no hubo una pérdida de peso obvia de nisina en la etapa inicial por debajo de 100 °C, lo que sugiere que quedó poca agua atrapada en la nisina en polvo debido a su escasa hidrofilia a pH neutro. Además, solo se observó una ligera pérdida de peso (<7%) para la nisina al final del proceso de calentamiento (600 °C), lo que podría deberse a su alto grado de cristalinidad. Otros investigadores han informado una estabilidad similar de la nisina en condiciones de calor seco30.

Las curvas TG (a) y dTG (b) de nisina, nisina-SACD, PM nisina + SACD y SACD.

Para SACD, se observaron dos etapas distintas de pérdida de masa durante el calentamiento en las curvas TG. La primera etapa se atribuyó a la evaporación de la humedad debido a la presencia de moléculas de agua atrapadas en la estructura hidrofílica de SACD, lo que contribuyó a alrededor del 4,5 % de la pérdida de peso total. Al final del calentamiento, casi el 67 % de la pérdida de peso se había producido en esta muestra, lo que se atribuyó principalmente a la degradación térmica de las moléculas SACD a alrededor de 300 °C y más.

Para los complejos de nisina-SACD, la pérdida de humedad durante la primera etapa de calentamiento fue ligeramente menor que para el SACD puro, lo que podría deberse a que una cierta cantidad de los grupos hidroxilo y carboxilo en el SACD estaban ocupados por la nisina y, por lo tanto, no estaban disponibles para las moléculas de agua. para adsorberse. También hubo una fuerte disminución de la masa alrededor de los 300 °C, que se atribuyó principalmente a la degradación térmica del SACD. A temperaturas más altas, la tasa de degradación térmica fue más rápida para los complejos de nisina-SACD que para el SACD puro, lo que puede deberse a que las fuerzas moleculares eran más débiles.

En comparación con los complejos de nisina-SACD, se mostró una menor pérdida de peso de la mezcla física de nisina y SACD al final del proceso de calentamiento. Podría deberse a que la nisina libre parte con una estructura cristalina altamente estable. Sugiere que la estabilidad al calor seco de las muestras reflejó y probó reacciones intermoleculares específicas en complejos de nisina-SACD. Sin embargo, los resultados no se correlacionaron directamente con la actividad biológica de la nisina, ya que el cambio en la estructura del péptido podría ocurrir incluso con una pérdida de masa insignificante31.

Para comprender mejor el proceso de calentamiento en seco, las curvas de tasa de cambio de masa de las muestras se calcularon a partir de las curvas TG (Fig. 2b). Las temperaturas en las que tuvo lugar la degradación térmica más rápida se pudieron observar fácilmente en los perfiles de dTG resultantes. El pico máximo de descomposición de la nisina se produjo a 333 °C, lo que sugiere que una pequeña cantidad de nisina débilmente cristalizada se degradó a esta temperatura. El pico máximo de descomposición de SACD se produjo a 326 °C, degradándose la mayor parte de esta sustancia a esta temperatura. Para el complejo nisina-SACD, se observó una temperatura de descomposición más baja de 317 °C, lo que es coherente con la presencia de fuerzas moleculares más débiles dentro de sus estructuras amorfas. Curiosamente, se observó un pico amplio alrededor de 504 °C para los complejos de nisina-SACD, lo que podría deberse a la degradación térmica progresiva del SACD en los complejos. Las mezclas físicas de nisina y SACD exhibieron una tasa máxima de descomposición en torno a los 337 °C, lo que se atribuyó a la degradación térmica del SACD.

La solubilidad y el comportamiento de complejación de nisina y SACD se investigaron mediante análisis de espectros UV-vis (Fig. 3). La absorbancia máxima de la nisina pura se produjo alrededor de 201 nm, lo que está relacionado con su estructura secundaria del esqueleto peptídico32. Sin embargo, este pico no pudo observarse en los espectros UV porque la concentración de nisina era demasiado baja. Para el SACD, se observó un pico a 280 nm, que puede estar relacionado con la absorción de ramificaciones insaturadas en las moléculas SACD33. Después de formar un complejo con SACD, la absorbancia de nisina en soluciones acuosas aumentó significativamente con el aumento de la concentración de SACD. Sugiere la solubilidad gradualmente mejorada de la nisina. En general, la nisina se reconoció como soluble en condiciones ácidas. Se observó que la solubilidad de la nisina incluso aumentó significativamente por SACD a pH 2,0 (Fig. 3a), lo que sugiere la aparición de cambios en el microambiente de la nisina. La longitud de onda de absorbancia máxima se desplazó de 201 a 204 nm gradualmente al aumentar las concentraciones de SACD. Este fenómeno de corrimiento al rojo demuestra una mayor fuerza de interacción hidrofóbica entre la nisina y el SACD, lo que contribuye a mejorar la no polaridad ambiental de la nisina16. Cuando el pH aumentó a 5,8, la absorbancia de nisina en soluciones mostró valores más altos a la misma concentración de SACD (Fig. 3b). La absorbancia máxima de la nisina se desplazó gradualmente hacia el rojo hasta 207 nm a medida que aumentaba la concentración de SACD. Estos resultados sugieren que la formación de complejos de nisina y SACD se hizo más fuerte a medida que aumentaba el pH. Se pudieron observar interacciones más intensas entre los dos componentes a pH 7,4 y 8,0 que se conocían como condiciones menos ventajosas para que la nisina se solubilizara5. Se mostró un fenómeno de corrimiento al rojo aún mayor a 211 nm en ambas situaciones alcalinas (Fig. 3c, d). Aunque la absorbancia máxima de la nisina disminuyó ligeramente, la solubilidad de la nisina aún se mantuvo en niveles altos en comparación con la nisina pura en las dos situaciones alcalinas.

Los espectros UV-visible de nisina-SACD con varias concentraciones de SACD (2, 4, 6, 8 y 10 mg/ml) a pH 2,0 (a), pH 5,8 (b), pH 7,4 (c) y pH 8,0 (d); la curva de ajuste de solubilidad de nisina-SACD a pH 2,0 (e), pH 5,8 (f), pH 7,4 (g) y pH 8,0 (h); y los espectros UV-visible de nisina libre y nisina complejada con SACD, HPCD y CD ya pH 2,0 (i), pH 5,8 (j), pH 7,4 (k) y pH 8,0 (l).

Las curvas de solubilidad de la nisina en soluciones SACD se trazaron a diferentes valores de pH (Fig. 3e-h). A pH 2,0, la absorbancia de la nisina aumentó linealmente con el aumento de la concentración de SACD. La propiedad hidrófila relativa de la nisina a pH 2,0 podría ser un beneficio para formar complejos con SACD, ya que existía más nisina solubilizada en las soluciones complejantes. Mientras que a un pH más alto de 5,8, 7,4 y 8,0, se observaron curvas ajustadas no lineales para la solubilidad de la nisina en soluciones de SACD. Este efecto podría atribuirse a las reacciones de adición nucleófila intermolecular que le sucedieron a la nisina, que redujeron la solubilidad de la nisina a un pH alcalino de 34. Afortunadamente, SACD mostró efectos satisfactorios que obstaculizan la transformación no deseada de la nisina en condiciones relativamente alcalinas, lo que hace que la nisina sea soluble en el rango de pH aplicado.

Para distinguir la efectividad de SACD en la ampliación del rango de aplicación de nisina, comparamos aún más el comportamiento de complejación de nisina con SACD y dos CD de uso común, β-CD y HP-β-CD (Fig. 3i-l). Tanto β-CD como HP-β-CD muestran mejoras considerables en la solubilidad de la nisina. Se observaron desplazamientos hacia el rojo obvios para la longitud de onda en la absorbancia máxima en condiciones alcalinas relativas (p. ej., la absorbancia máxima de nisina en solución de HP-β-CD apareció a 205 nm a pH 8,0). La absorbancia de nisina en soluciones que contenían HP-β-CD fue mayor que la que contenía β-CD para las cuatro situaciones de pH determinadas. Sin embargo, los valores máximos de absorbancia de nisina en soluciones SACD fueron mucho más allá del valor de nisina en soluciones β-CD o HP-β-CD. Por lo tanto, se puede concluir que SACD mostró algunas ventajas al promover la solubilidad de la nisina en situaciones neutras y alcalinas. Estos resultados indican que la complejación de nisina con SACD puede aumentar en gran medida su dispersabilidad en agua, lo que sería beneficioso para una mayor utilización de la nisina en diversas industrias.

La estabilidad de los complejos de nisina-SACD a diferentes valores de pH se evaluó midiendo la nisina solubilizada en soluciones después de 0 y 10 días de almacenamiento. El índice de retención (RI) se calculó a partir de estos datos y se utilizó para indicar la estabilidad de la nisina en los diferentes complejos (Fig. 4). Todas las muestras mostraron una buena estabilidad después de 10 días de almacenamiento, con valores de RI superiores al 100 %. Este resultado sugiere que la formación de complejos pudo estabilizar la nisina en todos los valores de pH estudiados y que la formación de complejos puede haber sido relativamente lenta. En particular, los valores de RI de la nisina en los complejos que contenían bajas concentraciones de SACD fueron apreciablemente más altos que los que contenían altas concentraciones. Según un estudio anterior, hay múltiples ramificaciones de éster en una molécula de SACD, que pueden unirse a la nisina, como lo muestra el análisis FTIR21. Como un péptido con una estructura molecular relativamente desordenada, es difícil que la nisina forme un complejo completo con moléculas SACD relativamente pequeñas. La nisina tarda un tiempo en extenderse y encontrar esos sitios desocupados en las superficies de las moléculas SACD. Cuando se incluyó más SACD en los sistemas, se observó un menor aumento del RI de la nisina. Puede deberse a que había menos sitios libres en la molécula de nisina disponibles para unirse al SACD.

El índice de retención (RI) de los complejos de nisina-SACD a diferentes concentraciones de SACD (2, 4, 6, 8 y 10 mg/ml) después de mantener un pH de 2,0, 5,8, 7,4 y 8,0 durante 10 días. La barra de error representa la desviación estándar de tres pruebas de la misma muestra.

Se determinó la resistencia de los complejos de nisina-SACD a la esterilización con vapor a alta temperatura porque la estabilidad térmica de las formulaciones es importante para las aplicaciones industriales. Estudios previos han demostrado que la degradación química de la nisina se produce cuando se procesa térmicamente34, lo que reduce su actividad antibacteriana3,35. Después de complejar con SACD, no se observó degradación térmica de la nisina a ningún pH estudiado y hubo un aumento apreciable en la cantidad de nisina solubilizada después del tratamiento térmico (Fig. 5). Estos efectos fueron más pronunciados para los complejos que contenían bajas concentraciones de SACD (2 mg/mL), que mostraron más del doble de nisina solubilizada en comparación con aquellos sin esterilización. El efecto de solubilización se hizo más notable a valores de pH más altos, con hasta tres veces más nisina solubilizada en la solución de SACD de 2 mg/mL después del tratamiento térmico. Cuando más moléculas de SACD estaban presentes durante el proceso de complejación, la mejora de la alta temperatura en la solubilización de la nisina parecía reducida, lo que podría deberse a que la saturación de los complejos entre la nisina y la SACD solo se producía gradualmente. Aun así, todavía se observó un aumento apreciable en el valor de RI para la nisina (> 120 %) a una concentración de SACD de 10 mg/mL. En un estudio previo, la complejación de la nisina con goma arábiga y pectina la protegió de la degradación térmica a 121 °C, pero no mejoró la solubilidad de la nisina1,3. Estos resultados sugieren que la complejación con SACD no solo aumentó la estabilidad térmica de la nisina, sino que también incrementó su solubilización durante el calentamiento.

El RI de los complejos de nisina-SACD con diferentes concentraciones de SACD (2, 4, 6, 8 y 10 mg/ml) y situaciones de pH (2,0, 5,8, 7,4 y 8,0) después de tratar a 121 °C durante 30 min. La barra de error representa la desviación estándar de tres pruebas de la misma muestra.

Finalmente, determinamos la actividad antibacteriana de los complejos nisina-SACD desarrollados en este estudio contra S. aureus. S. aureus se usa comúnmente como modelo de bacteria Gram-positiva para predecir los efectos antibacterianos del agente bacteriostático. Mientras tanto, es una causa importante de enfermedades transmitidas por los alimentos que provocan gastroenteritis, diarrea y vómitos36. Alimentos susceptibles a la intoxicación por S. aureus incluyendo carne, huevo y productos lácteos37. Se sabe que la nisina puede desactivar bacterias adsorbiéndose en la membrana celular, rompiendo la membrana celular y promoviendo la pérdida de componentes intracelulares esenciales38. Como se muestra en la Fig. 6a, la nisina pura exhibió solo una actividad antibacteriana moderada en las condiciones utilizadas, y el valor OD600 de la suspensión bacteriana disminuyó de 1,23 a 0,46 (2,7 veces). Para observar el cambio de la membrana celular de las bacterias después del tratamiento con complejos de nisina-SACD, se observó la microestructura de la superficie de las bacterias tratadas mediante la recopilación de imágenes SEM (Fig. 6b). La apariencia de la bacteria se transformó de esfera a forma irregular, demostrando la rotura de la membrana celular. Por el contrario, los complejos de nisina-SACD exhibieron una actividad antibacteriana mucho más fuerte, con una disminución del valor de OD600 a 0,04 (31 veces). Casi no se pudieron observar estructuras similares a células en la imagen SEM para la colección de cultivos tratados con complejos de nisina-SACD. Esta mayor actividad antimicrobiana se puede atribuir a la mayor solubilidad y estabilidad química de la nisina en los complejos. Además, el aumento del efecto bactericida de los complejos también podría deberse a alguna actividad antibacteriana del SACD. SACD contiene grupos carboxilo en su superficie que podrían crear un microambiente más ácido alrededor de las bacterias, lo que dificultaría su crecimiento27,39. En nuestro estudio anterior, SACD puro en una dosis relativamente alta mostró actividad antibacteriana contra S. aureus27. Nuestros resultados, por lo tanto, sugieren que la presencia de SACD mejoró los efectos antibacterianos de la nisina al formar complejos que aumentaron su solubilidad y actividad.

Los valores OD600 de los cultivos bacterianos sin ningún tratamiento y tratados con complejos SACD, nisina y nisina-SACD (a). Las imágenes SEM de S. aureus recolectadas de cultivos de las muestras en blanco, SACD, nisina y complejos de nisina-SACD (b). La intensidad de fluorescencia de bacterias vivas/muertas en cultivos de S. aureus tratados con muestras en blanco, SACD, nisina y complejos de nisina-SACD (c). La barra de error representa la desviación estándar de tres pruebas de la misma muestra.

Para respaldar la aplicación práctica de los complejos de nisina-SACD, se determinaron las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de nisina-SACD y HSS-nisina-SACD. Los dos complejos tenían MIC de 20 mg/mL y 40 mg/mL contra S. aureus, respectivamente. Sin embargo, no se observaron efectos antibacterianos significativos en el rango de concentración establecido para usar nisina y SACD solos. Aunque se observó una MIC más alta para HSS-nisina-SACD, la complejación con SACD aún muestra una protección y preservación significativas para la actividad biológica de la nisina después del tratamiento a alta temperatura. Después de tratar las bacterias con nisina-SACD o HSS-nisina-SACD en sus niveles de MIC, tanto las bacterias totales como las muertas existían en niveles bajos en comparación con el grupo no tratado (Fig. 6c). Indica que las proliferaciones de bacterias fueron efectivamente prohibidas. Se observó cierto grado de inhibición sobre la proliferación de bacterias simplemente tratando el cultivo de bacterias con nisina o SACD como se demostró anteriormente. Los resultados confirmaron nuevamente que la formación de complejos entre nisina y SACD exhibió un efecto sinérgico y mejoró significativamente la actividad biológica de nisina y SACD. Li et al. informaron de un efecto sinérgico similar entre la nisina y el carvacrol. 40

En este estudio, se utilizó SACD para mejorar la solubilidad, la estabilidad y la actividad antibacteriana de la nisina mediante la formación de complejos moleculares. Se infirieron fuertes interacciones entre las moléculas de nisina y SACD debido a los desplazamientos hacia el rojo apreciables de picos específicos observados en los espectros FTIR. La estructura molecular altamente cristalizada de la nisina se transformó en una estructura amorfa después de formar los complejos nisina-SACD. Las interacciones moleculares más débiles en los complejos que en la nisina pura redujeron su estabilidad térmica general. Sin embargo, la nisina dentro de los complejos parecía permanecer estable a la degradación a temperaturas más altas. La espectroscopia UV-visible sugirió que las interacciones entre la nisina y la SACD dependían del pH de la solución circundante, con interacciones más fuertes que ocurrían a valores de pH más altos. Estos resultados sugieren que la complejación de nisina con SACD podría mejorar su solubilidad, estabilidad y actividad en situaciones neutras y alcalinas. Además, la complejación mejoró la resistencia de la nisina a la esterilización con alto vapor. Finalmente, la actividad antibacteriana de los complejos nisina-SACD y HSS-nisina-SACD demostró ser mucho más eficaz que la nisina pura contra una bacteria Gram-positiva modelo (S. aureus). En general, nuestros resultados indican que la complejación de nisina con SACD tiene un gran potencial para mejorar su utilización como agente antibacteriano en formulaciones alimentarias o farmacéuticas. En el futuro, se requieren estudios in vitro e in vivo para evaluar la seguridad y eficacia de estos complejos. Además, será necesario superar cualquier obstáculo legal y de ampliación antes de que puedan usarse ampliamente para aplicaciones prácticas.

La nisina de Streptococcus lactis, la β-ciclodextrina (≥99,5 %, β-CD), el ácido succínico (SA) y el hipofosfito de sodio (SHP) se adquirieron de Aladdin Regent Co. (Shanghai, China). Otros productos químicos eran de grado analítico. Se utilizó agua desionizada para preparar soluciones acuosas en todos los experimentos.

SACD se preparó utilizando el método descrito en nuestro estudio anterior21. Brevemente, se mezclaron y agitaron 4,00 g de β-CD, 2,96 g de SA, 4,00 g de SHP y 40 ml de agua desionizada hasta que se solubilizaron por completo. Después de verter la solución mezclada en un plato circular (diámetro 160 mm), la muestra se secó en un horno a 100 °C durante 3 a 5 h. Luego, la placa se transfirió a otro horno a 140 °C y se mantuvo durante 20 min para permitir que ocurriera la reacción de esterificación. Después de enfriar las muestras esterificadas a temperatura ambiente (alrededor de 0,5 h), el producto crudo se recogió solubilizando primero en 20 ml de agua desionizada y luego se precipitó agregando un volumen en exceso de etanol absoluto. Este proceso de lavado se repitió otras dos o tres veces para asegurar que no quedaran impurezas en el producto final. Después de lo cual, la muestra se secó durante la noche para eliminar el etanol y se recogió el producto final.

La nisina se acomplejó con SACD solubilizando 1 mg de nisina en 10 ml de solución de SACD (400 mg/ml). Después de mezclar bien, la solución se centrifugó a 10.000 rpm durante 5 min para eliminar las sustancias insolubles. El sobrenadante se recogió y se liofilizó para convertirlo en forma de polvo para la evaluación del estado sólido.

Se evaluó el impacto del pH sobre la solubilidad de la nisina en soluciones de SACD. Se prepararon soluciones con concentraciones de SACD de 0, 2, 4, 6, 8 y 10 mg/ml solubilizando SACD en solución tampón con diferentes valores de pH. Las muestras resultantes se denominan nisina libre, nisina-SACD2, nisina-SACD4, nisina-SACD6, nisina-SACD8 y nisina-SACD10, respectivamente. Excepto cuando se usó HCl para ajustar el pH a 2,0, se usaron soluciones tampón de fosfato para preparar diferentes valores de pH (5,8, 7,4 y 8,0). Luego, se añadió 1 mg de nisina a las soluciones de SACD anteriores con diferentes valores de pH. La concentración de SACD osciló entre 2 y 10 mg/ml en cada valor de pH. Las suspensiones resultantes se agitaron durante 8 h a 25 °C para que la nisina alcanzara la solubilización saturada. Después de eliminar las sustancias no disueltas pasando por filtros de tamaño de poro de 0,45 μm, la cantidad solubilizada de nisina se cuantificó utilizando un espectrofotómetro UV-visible (UV-1800PC, Mapada, China) a 201 nm. Las interacciones huésped-huésped entre nisina y SACD se pudieron observar a partir de los cambios de longitud de onda de absorbancia máxima de nisina después de formar un complejo con SACD. Las curvas de solubilidad de nisina en soluciones de SACD a diferentes valores de pH se construyeron luego representando el valor de absorbancia en función de la concentración de SACD. Se prepararon grupos de control adicionales que usaban nisina complejada con 10 mg/ml de β-CD y 10 mg/ml de HP-β-CD a pH 7,4 para probar la eficacia de nisina-SACD. Las muestras se denominan nisina-CD10 y nisina-HPCD10, respectivamente. Todos los demás procedimientos utilizados para preparar las soluciones complejas fueron los mismos que para las muestras de nisina-SACD.

Los espectros infrarrojos de las muestras en polvo se recopilaron utilizando un espectrómetro FTIR (Nicolet Nexus 470, Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, EE. UU.) con números de onda de 400 a 4000 cm−1.

La estructura cristalina de los complejos potenciados de nisina-SACD se determinó mediante análisis de difracción de rayos X (XRD) utilizando un instrumento comercial (D2 PHASER, Bruker, Alemania) a un voltaje operativo de 40 kV y un rango de ángulo de difracción (2θ) de 4 ° a 40°.

El comportamiento térmico de los complejos nisina-SACD se evaluó mediante un sistema de análisis termogravimétrico (TG) (TGA2, Mettler–Toledo, Schwerzenbach, Suiza) bajo N2 (50 mL/min) a una velocidad de calentamiento de 10 °C/min a una temperatura rango de 30 a 600 °C.

Para evaluar los efectos del pH sobre la estabilidad de nisina-SACD, se determinó la cantidad de nisina en las soluciones complejas 10 días después de la solubilización. La duración del almacenamiento se fijó en base a experimentos preliminares que garantizaron que el proceso de complejación alcanzara el equilibrio total. La estabilidad térmica de los complejos nisina-SACD también se evaluó exponiéndolos a un tratamiento de esterilización con vapor a alta presión a 121 °C durante 30 min. La fracción de nisina solubilizada dentro de los complejos de nisina-SACD se determinó midiendo la absorbancia a 201 nm utilizando un espectrofotómetro UV-visible (UV-1800PC, Mapada, China). Como grupo de control, se llevaron a cabo los mismos procedimientos sobre una suspensión de nisina. Luego se calculó el índice de retención (IR) usando la siguiente ecuación:

Las actividades antimicrobianas de las muestras se determinaron utilizando S. aureus (ATCC 6538) como bacteria Gram-positiva representativa. La densidad óptica (DO) se utilizó para evaluar la actividad antibacteriana de la nisina y los complejos nisina-SACD41,42. Las bacterias se precultivaron en medio Luria-Bertani a 37 °C durante 24 h para obtener cultivos de semillas. Estos cultivos de semillas luego se diluyeron a 106 CFU utilizando medios Luria-Bertani. Se pesaron 1 mg de nisina, 50 mg de nisina-SACD (que contenía 1 mg de nisina) y 50 mg de SACD y se añadieron por separado a 10 ml de cultivo bacteriano diluido. Se utilizó un cultivo bacteriano que no contenía muestra como grupo de control en blanco. Después de incubar a 37 °C durante 24 h, se determinó el crecimiento de bacterias en los medios de cultivo registrando la DO a 600 nm (OD600) con un espectrofotómetro UV-visible (UV–1800PC, Mapada, China).

Después de confirmar la actividad antibacteriana de los complejos de nisina-SACD, la MIC de los complejos de nisina-SACD se midió más a fondo mediante el método de microdilución en caldo, según lo informado por Li et al. 40. La concentración inicial de nisina, SACD, nisina-SACD y nisina-SACD esterilizada con vapor a alta presión (HSS-nisina-SACD) se fijó en 400 µg/mL, 40 mg/mL, 40 mg/mL (que contiene 400 µg/ml de nisina) y 40 mg/ml (que contiene 400 µg/ml de nisina), respectivamente. A continuación, las soluciones iniciales se diluyeron en serie hasta que la concentración de las mismas alcanzó 3,125 µg/mL, 0,3125 mg/mL, 0,3125 mg/mL y 0,3125 mg/mL, respectivamente. A continuación, se cultivaron 100 µl de las muestras a diferentes concentraciones con diluciones de 100 µl de S. aureus que contenían 106 CFU de bacterias en placas de 96 pocillos. Las placas se incubaron a 37 °C durante 24 h. La concentración a la que la DO600 no fue significativamente diferente de la del grupo en blanco (sin inoculación bacteriana) se consideró como CIM. S. aureus tratado con nisina-SACD y HSS-nisina-SACD en MIC se tiñeron más usando un kit de doble tinción de bacterias vivas/muertas (LMAI Bio, China), y el número de bacterias totales y bacterias muertas podría representarse mediante la fluorescencia. valor de intensidad directamente. Tenga en cuenta que no existe una relación estadística entre la intensidad de fluorescencia de las bacterias totales y las bacterias muertas, ya que se tiñen con dos tintes fluorescentes diferentes.

Después de cultivar con nisina-SACD, SACD y nisina, la morfología de las bacterias se visualizó utilizando un microscopio electrónico de barrido (SU8100, SEM, Hitachi, Japón). Las muestras se depositaron en cinta de negro de carbón y luego se recubrieron con oro antes del análisis.

Todas las mediciones se realizaron en muestras separadas por triplicado. Los resultados que dieron valores numéricos se presentan como medias ± desviaciones estándar. El análisis ANOVA de los datos experimentales se llevó a cabo utilizando el software estadístico SPSS 20 (SPSS Inc., Chicago, EE. UU.). Las diferencias se consideraron a un nivel de significancia del 95% (p < 0,05).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (BK20210458).

Laboratorio estatal clave de ciencia y tecnología alimentaria, Escuela de ciencia y tecnología alimentaria, Centro de innovación colaborativa de seguridad alimentaria y control de calidad en la provincia de Jiangsu, Universidad de Jiangnan, Wuxi, Jiangsu, 214122, China

Yao Hu, Kequan Xing, Long Chen, Jie Long, Aiquan Jiao, Xueming Xu, Zhengyu Jin y Chao Qiu

Facultad de Industria Ligera e Ingeniería de Alimentos, Universidad Forestal de Nanjing, Nanjing, Jiangsu, 210037, China

Xiaojing Li

Facultad de Ciencias Alimentarias y Farmacéuticas, Universidad de Ningbo, 169 Qixing South Road, Ningbo, Zhejiang, 315832, China

Shangyuan cantó

Departamento de Ciencias de la Alimentación, Universidad de Massachusetts, Amherst, MA, 01060, EE. UU.

David Julián McClements

Centro de Innovación Avanzada de Beijing para Nutrición Alimentaria y Salud Humana, Laboratorio Conjunto China-Canadá de Nutrición Alimentaria y Salud (Beijing), Escuela de Alimentos y Salud, Universidad de Tecnología y Negocios de Beijing (BTBU), 11 Fucheng Road, Beijing, 100048, China

Jin Peng Wang

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Correspondencia a Jinpeng Wang, Zhengyu Jin o Chao Qiu.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Hu, Y., Xing, K., Li, X. et al. El carboxilato de ciclodextrina mejora la estabilidad y la actividad de la nisina en una gama más amplia de condiciones de aplicación. npj Sci Food 7, 20 (2023). https://doi.org/10.1038/s41538-023-00181-7

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Recibido: 01 Agosto 2022

Aceptado: 13 febrero 2023

Publicado: 20 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41538-023-00181-7

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