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Jan 13, 2024

El potencial de la levadura tolerante al estrés múltiple, Saccharomycodes ludwigii, para la segunda

Informes científicos volumen 12,

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 22062 (2022) Citar este artículo

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La producción de etanol a altas temperaturas utilizando biomasa lignocelulósica como materia prima requiere una levadura etanológena tolerante a inhibidores termo y lignocelulósicos altamente eficiente. En este estudio, se obtuvieron sesenta y tres aislados de levadura de frutas tropicales ácidas usando un medio acidificado selectivo que contenía ácido acético glacial 80 mM. Veintinueve de los aislados de levadura exhibieron significativas capacidades fermentativas tolerantes al ácido acético y termo. Todos estos aislamientos se clasificaron en tres especies principales de levadura, a saber, Saccharomycodes ludwigii, Pichia kudriavzevii y P. manshurica, según la identificación molecular. Saccharomycodes ludwigii APRE2 mostró la capacidad de crecer a altas temperaturas de hasta 43 °C y exhibió una tolerancia multiestrés significativa hacia el ácido acético, furfural, 5-hidroximetil furfural (5-HMF) y etanol entre las especies de levaduras aisladas. Puede producir una concentración máxima de etanol de 63,07 g/L y una productividad de 1,31 g/Lh en medio de extracto de malta y extracto de levadura (YM) que contiene 160 g/L de glucosa y suplementado con ácido acético 80 mM y furfural 15 mM como inhibidor del cóctel. Cuando se utilizó como materia prima un hidrolizado de desecho de piña pretratado con ácido (PWH) que contenía aproximadamente 106 g/L de azúcares totales, ácido acético 131 mM y furfural 3,95 mM, se obtuvo una concentración y productividad de etanol de 38,02 g/L y 1,58 g/Lh. respectivamente, se lograron. Según los resultados del estudio actual, la nueva levadura termotolerante al ácido acético y S. ludwigii APRE2 exhibió un excelente potencial para la producción de bioetanol de segunda generación a altas temperaturas.

La crisis energética mundial y la contaminación ambiental resultante de la utilización de combustibles fósiles se han convertido en uno de los problemas globales más importantes1. Aproximadamente el 88 % de la utilización actual de energía se deriva de combustibles fósiles, como el petróleo crudo, el carbón y el gas natural, y es probable que aumente en un 50 % en los próximos 50 años. Sin embargo, según la tasa de consumo actual, estos combustibles fósiles pueden agotarse en aproximadamente 120 años2,3,4,5. Además, la quema de combustibles fósiles o la eliminación inadecuada de los desechos de combustibles fósiles también provoca una grave contaminación ambiental, lo que tiene un impacto negativo en la salud humana y animal6. Por lo tanto, se necesita una forma factible de investigar el uso de biocombustibles como una alternativa más limpia a los combustibles fósiles. Los biocombustibles ofrecen varios beneficios, como una seguridad energética mejorada a largo plazo, emisiones reducidas de gases de efecto invernadero, contaminación ambiental reducida asociada con la utilización de combustibles fósiles y demanda reducida de petróleo5. Se han fabricado muchos biocombustibles renovables, como bioetanol, biodiésel, biobutanol y biohidrógeno; entre estos, el bioetanol es uno de los biocombustibles más populares utilizados en todo el mundo debido a su sostenibilidad ambiental y naturaleza renovable en comparación con los combustibles fósiles. Entre las diferentes generaciones de producción de bioetanol, la segunda generación que utiliza biomasa lignocelulósica como materia prima ha recibido un gran interés frente a otras generaciones de producción de bioetanol7,8. No solo no tiene impacto en la seguridad alimentaria, sino que también proporciona crecimiento económico en las zonas rurales9,10. Los cultivos energéticos y los residuos de biomasa verde o biorresiduos de los sectores industriales o agrícolas, como el bagazo de caña de azúcar, la pulpa de mandioca, la paja de arroz, la paja de trigo, la mazorca de maíz y los residuos de piña, son las materias primas principales para la producción de bioetanol de segunda generación11.

Las biomasas lignocelulósicas se componen típicamente de celulosa, hemicelulosa y lignina con una estructura compleja; por lo tanto, se necesita un proceso de pretratamiento para convertir estos materiales de lignocelulosa en monómeros de azúcar fermentables para el crecimiento y la fermentación de etanol por parte de microorganismos etanologénicos. Se han utilizado varios métodos, como el físico, el químico, el físico-químico y el biológico, para el pretratamiento lignocelulósico12. Entre las diversas técnicas, el proceso de pretratamiento químico, en particular un pretratamiento con ácido diluido que utiliza ácido sulfúrico (H2SO4) a temperaturas que oscilan entre 120 °C y 180 °C, es el más utilizado debido a su alta eficiencia en la separación de los componentes de la pared celular, lo que produce azúcares altamente fermentables, operación fácil y de bajo costo debido a la aplicación de condiciones de baja temperatura y aplicabilidad a una amplia gama de biomasas13,14,15,16.

El proceso de pretratamiento lignocelulósico genera no solo azúcares fermentables sino también subproductos derivados de la lignocelulosa, que se conocen como inhibidores del pretratamiento lignocelulósico, que pueden inhibir el crecimiento y el metabolismo microbianos, así como la actividad de fermentación17,18,19,20. Los principales inhibidores del pretratamiento lignocelulósico incluyeron ácidos débiles (ácido acético y ácido fórmico), derivados de furano (furfural y 5-hidroximetil furfural (5-HMF)) y compuestos fenólicos (fenol y O-metoxifenol)21,22. De estos, el ácido acético y el furfural son dos de los inhibidores más predominantes en el hidrolizado pretratado con ácido diluido23,24. El ácido acético se forma por la desacetilación de la hemicelulosa y en parte por la degradación de la celulosa y la lignina, mientras que el furfural es un producto común de degradación de la hemicelulosa. El contenido de inhibidor generado durante el proceso de pretratamiento depende del tipo de biomasa, su concentración y los parámetros de pretratamiento, como el tiempo, la temperatura de operación y la concentración de catalizadores21,25. Altas concentraciones de ácido acético (7.5–15.0 g/L) causaron una reducción considerable en la biomasa máxima de células de levadura al prolongar la fase de latencia y reducir las tasas específicas de crecimiento26,27. La disociación del ácido acético dentro de la célula microbiana disminuye el pH intracelular, reduciendo la viabilidad celular y el rendimiento de producción de etanol28. De manera similar, la tasa de crecimiento microbiano específico, la masa celular total, el rendimiento de ATP y la eficiencia de producción de etanol disminuyeron a medida que aumentaba la concentración de furfural en el medio de fermentación23. Varias estrategias, como la desintoxicación del hidrolizado lignocelulósico mediante métodos químicos o biológicos, una adaptación evolutiva de microorganismos etanologénicos en presencia de potentes inhibidores y la ingeniería genética microbiana, se han llevado a cabo para superar el impacto negativo de estos inhibidores21,23. Sin embargo, estos enfoques requieren mucho tiempo, un costo relativamente alto y una baja eficiencia. Por lo tanto, una cepa tolerante a inhibidores potenciales de microorganismos etanologénicos que pueden fermentar azúcares de hexosa y pentosa en hidrolizado lignocelulósico es muy deseable para la producción de bioetanol de segunda generación. Además, el proceso de conversión biológica que usa cócteles de enzimas para la producción eficiente de azúcar y la reducción de compuestos fenólicos podría ser una alternativa para mejorar la actividad de fermentación de etanol microbiano22. Se han aislado y seleccionado varias levaduras etanológenas tolerantes a inhibidores de diferentes nichos, y se ha informado sobre la fermentación de etanol utilizando biomasa lignocelulósica como materia prima, en la que las cepas tolerantes al estrés múltiple con mayor potencial pertenecían a Pichia sp. Por ejemplo, Chamnipa et al.29 aislaron P. kudriavzevii RZ8-1 de muestras de suelo y exhibieron la capacidad de soportar una temperatura alta de 45 °C y crecer en un medio que contenía hasta 7,5 g/L de ácido acético y 12 % de ácido acético. (v/v) etanol. Esta cepa de levadura puede producir las concentraciones más altas de etanol de 35,51 y 33,84 g/L a 37 °C y 40 °C, respectivamente, utilizando hidrolizado de bagazo de caña de azúcar como materia prima. P. kudriavzevii ITV-S42 aislado de jugo de sorgo dulce por Díaz-Nava et al.30 mostró un potencial significativo para la tolerancia a múltiples estrés, como ácido acético (hasta 24 g/L), furfural (hasta 1 g/L) y 5 -HMF (hasta 1 g/L), y produjo el máximo rendimiento y productividad de etanol de 0,376 g de etanol/g de glucosa y 0,54 g/Lh, respectivamente. Avchar et al.31 afirmaron que P. kudriavzevii RGB3.2 aislado de rumen de búfalo albergaba una capacidad de tolerancia significativa hacia furfural, 5-HMF, ácido acético y etanol en concentraciones de hasta 1,5 g/L, 3 g/L, 0,4 % ( v/v), y 10% (v/v), respectivamente. La cepa de levadura produjo una concentración máxima de etanol de 9,1 g/L a partir de hidrolizado de paja de arroz utilizando un proceso de sacarificación y fermentación simultánea (SSF) a 45 °C. Phong et al.32 reportaron recientemente otra especie de levadura tolerante a múltiples estrés, Saccharomyces cerevisiae HG1.1, aislada de muestras de suelo en Vietnam. Presentó tolerancia significativa al ácido acético a 4 g/L y al etanol al 14% (v/v) y produjo una concentración máxima de etanol de 36,85 g/L con una productividad de 3,07 g/Lh a 40 °C utilizando hidrolizado de desecho de piña ( PWH) como materia prima.

Hasta donde sabemos, solo unos pocos estudios han considerado el aislamiento de levaduras termotolerantes, que poseen tolerancia multiestrés hacia el ácido acético y el furfural de frutas ácidas tropicales. Por lo tanto, en este estudio, se realizó el aislamiento, la detección y la selección de levaduras etanológenas termotolerantes potenciales capaces de tolerancia multiestrés hacia los inhibidores lignocelulósicos de frutas ácidas tropicales recolectadas en el noreste de Tailandia. También se evaluaron la identificación molecular, la caracterización del crecimiento y el rendimiento de la producción de etanol de los aislados de levadura seleccionados utilizando glucosa y PWH como materias primas. Los resultados del presente estudio demostraron que la levadura S. ludwigii APRE2 tolerante al ácido acético y al termo recientemente aislada exhibió un alto potencial para la producción de bioetanol de segunda generación a partir de biomasa lignocelulósica.

Frutas ácidas tropicales, a saber, piña (Ananas comosus), maracuyá (Passiflora edulis), tamarindo de Manila (Pithecellobium dulce), carambola (Averrhoa carambola), ma fai o rambai (Baccaurea ramiflora), pitaya (Hylocereus undatus), azufaifa (Ziziphus jujuba), korlan (Nephelium hypoleucum), mango (Mangifera indica) y naranja (Citrus sp.), se utilizaron en este estudio. Las plantas utilizadas en esta investigación no son silvestres sino cultivadas en las provincias de Maha Sarakham, Roi Et y Nong Khai, Tailandia. Las piñas y las naranjas se recolectaron de los mercados locales en la provincia de Maha Sarakham, mientras que otras frutas se recolectaron de un jardín de frutas local en la provincia de Roi Et, Tailandia, con el permiso de la propietaria, la Sra. Thongbol Punmill.

Los desechos de piña (cáscara y corazón de piña) utilizados para la fermentación de etanol se recolectaron del Centro de Servicios de Alimentos de la Universidad de Khon Kaen con el permiso de la Oficina de la Universidad. Se depositó un espécimen de prueba (material seco) en el Departamento de Biotecnología de la Facultad de Tecnología de la Universidad de Khon Kaen, con el número de código KKUDB-PPC-2018–01. Todos los métodos se llevaron a cabo siguiendo las directrices pertinentes en la sección de métodos.

Las frutas ácidas tropicales recolectadas se lavaron y enjuagaron con agua destilada esterilizada para eliminar los contaminantes, incluido el polvo o los microbios, en la superficie de la fruta y se trituraron hasta obtener una pulpa homogénea usando un molinillo. Diez gramos de pulpa de fruta se transfirieron a un matraz Erlenmeyer de 250 mL que contenía 100 mL de medio de extracto de malta (YM) de extracto de levadura acidificado selectivo (3 g/L de extracto de levadura, 3 g/L de extracto de malta, 5 g/L de peptona, 10 g/L de glucosa y ácido acético glacial 80 mM) y se incubó a 35 °C y 150 rpm durante 3 días para obtener las cepas de levadura termotolerantes33. Después de una dilución en serie de diez veces, se esparcieron 10 μL de cada muestra en agar YM con alto contenido de ácido acético complementado con ácido acético glacial 80 mM y luego se incubó a 35 °C durante 3 días. Las diferentes colonias individualizadas fueron seleccionadas en base a su morfología, tamaño y color y luego purificadas en medio agar YM. Todos los cultivos puros se recogieron mediante subcultivos repetidos en medio de agar YM incubado a 35 °C y mantenido en agar YM inclinado a 4 °C para almacenamiento a corto plazo y en solución de glicerol al 50 % (v/v) a -20 °C. para el almacenamiento a largo plazo.

Las cepas de levadura fermentativa se examinaron en cuanto a su capacidad para fermentar glucosa utilizando el ensayo de tubo de Durham. Los cultivos puros de los aislados de levadura se suspendieron en un tubo de ensayo de 20 × 20 mm con volúmenes de trabajo de 10 mL de medio YM (160 g/L de glucosa) suplementado con ácido acético glacial 80 mM y se incubaron a 35 °C y 150 rpm durante 3 días. Las cepas de levadura que podían fermentar azúcar y acumular un alto nivel de CO2 en el tubo de Durham fueron seleccionadas para experimentos posteriores. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron dos veces.

Los aislados de levadura seleccionados se identificaron utilizando el dominio morfológico y D1/D2 de la subunidad grande (LSU) rDNA análisis de secuenciación34. El ADN genómico aislado de células de levadura se usó como plantilla para amplificar el dominio D1/D2 de LSU-rDNA, que se realizó usando los cebadores específicos NL-1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG) y NL- 4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G)35. Según las instrucciones del fabricante, la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó utilizando una mezcla maestra de PCR (QIAGEN, Dialunox GmbH, Alemania). Los productos de PCR resultantes se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8 % y se purificaron con un kit NucleoSpin® Extract II (Machery-Nagel GmbH & Co. KG, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias del dominio D1/D2 de LSU-rDNA se analizaron mediante el método de terminación de cadena dideoxi y el análisis de búsqueda de homología se realizó mediante los programas FASTA y BLAST en las bases de datos GenBank y DDBJ.

El análisis filogenético se construyó usando el programa MEGA XI36, y las topologías de los árboles se analizaron mediante arranque con 1000 repeticiones basadas en el método de unión de vecinos37.

La capacidad de crecimiento de las levaduras aisladas se probó en condiciones de alta temperatura transfiriendo los cultivos aislados de levadura pura a un tubo de ensayo de 20 × 20 mm que contenía 10 ml de medio YM suplementado con ácido acético glacial 80 mM e incubado a diferentes temperaturas de 30 ° C, 37 °C, 40 °C, 43 °C y 45 °C en un agitador incubador de temperatura controlada (JSSI-100 T, JS Research Inc., Corea) a 150 rpm durante 48 h. El crecimiento fue monitoreado en términos de viabilidad celular utilizando un hemocitómetro (H-0004, Boeco, Alemania) con tinción de azul de metileno. El perfil de asimilación de azúcar de las levaduras aisladas se evaluó inoculando las células de levadura en un medio YM suplementado con 20 g/L de diferentes azúcares, a saber, glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa, maltosa, sacarosa y lactosa. Después de la incubación a 30 °C durante 48 h, se determinó la asimilación de azúcar siguiendo el protocolo estándar38.

El efecto inhibitorio de los inhibidores de pretratamiento lignocelulósico, incluidos el ácido acético, el furfural, el 5-HMF y el etanol, sobre el crecimiento de levaduras aisladas se evaluó mediante un ensayo de cultivo líquido. El inóculo de levadura se preparó transfiriendo un asa de cultivo puro de levaduras aisladas a un matraz Erlenmeyer de 125 mL que contenía 50 mL de medio YM, el cual se incubó a 35 °C y 150 rpm durante 18 h (cuando el crecimiento alcanzó la mitad de la temperatura). fase exponencial). Las células se recogieron por centrifugación a 1844 × g, se resuspendieron en una solución estéril de NaCl al 0,85 % para obtener una concentración celular inicial de 1 × 106 células/mL y se usaron como cultivo iniciador para otros experimentos39. Para estrés con ácido acético, furfural, 5-HMF y etanol, las células se transfirieron a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 100 ml de medio YM suplementado con diferentes concentraciones de ácido acético (80 mM, 120 mM y 160 mM), furfural (5 mM, 10 mM y 15 mM), 5-HMF (10 mM, 15 mM y 20 mM) o etanol (4 %, 6 % y 8 % v/v)33,40 y luego se incubaron a 35 °C en un agitador incubador de temperatura controlada (JSSI-100 T, JS Research Inc., Corea) a 150 rpm. Se usó medio YM sin suplemento de inhibidor como control. Después de 48 h de incubación, la viabilidad de las células de levadura se midió utilizando un hemocitómetro (H-0004, Boeco, Alemania) con tinción de azul de metileno.

El ácido acético y el furfural son los inhibidores de pretratamiento lignocelulósico predominantes que afectan negativamente el crecimiento microbiano y el potencial de producción de etanol23,24. En este estudio, se evaluó el efecto del ácido acético y el furfural sobre la capacidad de producción de etanol de las levaduras seleccionadas usando un medio YM que contenía 160 g/L de glucosa suplementado con ácido acético 80 mM o furfural 15 mM como medio de fermentación. Como tratamiento de control se utilizó medio YM que contenía 160 g/l de glucosa sin suplemento de inhibidor. Se transfirió un cultivo iniciador de cada levadura aislada a un medio de fermentación con una concentración celular inicial de 1 × 107 células/mL y se incubó a 37 °C en un agitador incubador de temperatura controlada (JSSI-100 T, JS Research Inc., Corea) a 150 rpm. Los caldos de fermentación se recogieron a intervalos de tiempo específicos y se analizaron la concentración de etanol y la productividad.

El efecto de las condiciones de estrés múltiple en la producción de etanol por levaduras aisladas seleccionadas se investigó usando medio YM que contenía 160 g/L de glucosa y complementado con un cóctel de inhibidores que comprendía ácido acético 80 mM y furfural 15 mM como medio de fermentación. Se transfirió un cultivo iniciador de aislados de levadura seleccionados a un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 100 ml de medio de fermentación con una concentración celular inicial de 1 × 107 células/ml. Los matraces se incubaron a 37 °C en un agitador incubador de temperatura controlada (JSSI-100 T, JS Research Inc., Corea) a 150 rpm, y las muestras se recolectaron a intervalos de tiempo específicos durante la fermentación de etanol y luego se analizaron. Como tratamiento de control se utilizó un medio de fermentación sin inhibidores.

La PWH se preparó utilizando el método descrito por Rattanapoltee y Kaewkannetra41. En resumen, se trataron desechos de piña seca de 0,5 × 0,5 cm con ácido sulfúrico (H2SO4) al 0,5 % (v/v) a 121 °C durante 15 min usando un autoclave (HV-50II, Hirayama, Japón). Después de la hidrólisis ácida, el sedimento se eliminó por centrifugación y el sobrenadante resultante se recogió y se usó como materia prima para la fermentación de etanol. El PWH se almacenó a -20 °C hasta su uso. Las composiciones químicas en el PWH, incluidos azúcares, ácido acético, furfural, 5-HMF y ácido fenólico, se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un detector de índice de refracción (IR) (Shimadzu, Kyoto, Japón) utilizando Columna Aminex HPX-87H (300 × 7,8 mm) (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) a 50 °C. Se utilizó H2SO4 5 mM como fase móvil a un caudal de 0,6 ml/min.

La fermentación discontinua de etanol se realizó utilizando un matraz Erlenmeyer de 250 ml que contenía 100 ml de PWH como medio de fermentación. El medio se inoculó con células de levadura seleccionadas con una concentración celular inicial de 1 × 107 células/mL y se incubó a 37 °C en un agitador incubador de temperatura controlada (JSSI-100 T, JS Research Inc., Corea) a 150 rpm. Las muestras se recogieron a intervalos de tiempo específicos durante la fermentación del etanol y se analizaron.

Los azúcares residuales totales en el caldo de fermentación se midieron utilizando el método del ácido fenolsulfúrico42. Se empleó el método de conteo directo utilizando un hemocitómetro (H-0004, Boeco, Alemania) con tinción de azul de metileno para determinar el número de células de levadura viables43. La concentración de etanol se determinó por cromatografía de gases (GC) (Shimadzu GC-14B, Kyoto, Japón) utilizando una columna empacada de polietilenglicol (PEG-20 M) con detector de ionización de llama, siguiendo el protocolo descrito por Laopaiboon et al.44 . El rendimiento de etanol (Yp/s, g/g), la productividad volumétrica de etanol (Qp, g/Lh) y la eficiencia de conversión o eficiencia de rendimiento (Ey, %) se calcularon según lo descrito por Nuanpeng et al.45.

Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se repitieron dos veces. Los resultados se expresaron como medias ± desviación estándar (DE), y las diferencias de medias entre cada tratamiento se analizaron mediante la prueba de rangos múltiples de Duncan (DMRT) a una probabilidad de p ≤ 0.05 utilizando el programa SPSS para Windows.

La fermentación de etanol a alta temperatura (HTEF) utilizando levaduras etanológenas tolerantes al ácido acético y termoeficientes es una estrategia prometedora para la producción de bioetanol de segunda generación a alta temperatura utilizando biomasa lignocelulósica como materia prima. Con base en la revisión de la literatura, solo unos pocos informes sobre el aislamiento de levaduras tolerantes al ácido termo y acético de frutas ácidas tropicales. Por lo tanto, este estudio explotó una nueva fuente potencial para el aislamiento, la detección y la selección de levaduras termotolerantes al ácido acético y termo de alto potencial para la producción de etanol a alta temperatura. Con base en las características morfológicas de la levadura, se obtuvo un total de sesenta y tres aislados de levadura de diferentes muestras de frutas ácidas tropicales. La mayoría de las colonias de levadura eran circulares con un diámetro de 1 a 2 mm, pero sus colores variaban de blanco a crema o tostado (datos no mostrados). Las levaduras fermentativas etanológenas podrían examinarse preliminarmente utilizando el ensayo de tubo de Durham, una de las técnicas ampliamente utilizadas para examinar y seleccionar levaduras productoras de etanol termotolerantes de alto potencial45,46. Con base en el ensayo de tubo de Durham a 35 °C usando medio YM que contiene 160 g/L de glucosa suplementado con ácido acético glacial 80 mM, veintinueve aislados de levadura, o el 46 % de los aislados de levadura, exhibieron una alta capacidad para fermentar glucosa y acumular glucosa. altos niveles de CO2 en los tubos. Por lo tanto, se seleccionaron los veintinueve aislados de levadura fermentativa para su posterior caracterización.

Se han aislado varias levaduras fermentativas etanológenas de diferentes fuentes, por ejemplo, suelo, bebidas alcohólicas, materiales vegetales, como hojas y tallos de alcachofa de Jerusalén, jugo de caña de azúcar, jugo de sorgo dulce, frutos podridos y flores de plantas29,45,46, 47,48, rumen de búfalo31 y alimentos naturalmente fermentados49. Según los resultados obtenidos en el presente estudio, las frutas ácidas tropicales también son un nicho potencial para el aislamiento de levaduras fermentativas etanológenas, entre otras fuentes.

Los veintinueve aislados de levadura seleccionados se identificaron a nivel de especie mediante análisis de secuenciación del dominio D1/D2 de LSU-rDNA. Con base en los análisis filogenéticos y de homología de las secuencias de nucleótidos en la base de datos GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), se aclararon tres especies principales de levadura, es decir, Saccharomycodes ludwigii, Pichia kudriavzevii (antigua nombre: Issatchenkia orientalis) y P. manshurica (P. galeiformis) (Fig. 1). Saccharomycodes ludwigii fue la especie de levadura más común entre las levaduras fermentativas seleccionadas. Veintidós aislamientos, a saber, ACP20, ACP21, ACP22, ACP24, ACP26, RBRE1, RBRE2, DGRE1, DGRE2, LFRE1, LFRE2, SNRM1, SNRM2, APRE1, APRE2, MGRE1, MGRE2, RR1, RR2, RR3, RR4 y OR2, se identificaron como S. ludwigii con una identidad de secuencia del 99,3–100 %. Seis aislados, LF56, LF98, LF101, LF119, AC1 y AC4, pertenecían a P. kudriavzevii con una identidad de secuencia del 100 %, y un aislado, es decir, LF137, se identificó como P. manshurica con una identidad de secuencia del 99,5 % (Tabla 1) . Curiosamente, S. ludwigii se encontró principalmente en casi todas las muestras de frutas, excepto en maracuyá, tamarindo de Manila y korlan, mientras que P. manshurica se restringió solo a carambola. P. manshurica se aisló por primera vez de una bebida alcohólica en Manchuria50, pero luego se encontró en otras fuentes diferentes, por ejemplo, sedimentos de desecho y jugo de caña de azúcar de fábricas de caña de azúcar51, suelo48 y varios alimentos y bebidas fermentados, como aceitunas de mesa, granos de cacao , koumiss, vinagre, té fermentado o kombucha y vinos mimados52,53,54. Aunque se considera una de las levaduras de deterioro que causan graves problemas a las industrias del vino, P. manshurica también tiene un buen potencial para la producción de etanol y vinagre51,55.

Árbol filogenético del dominio D1/D2 del gen LSU rDNA de la unión de vecinos que representa las relaciones entre las cepas tipo de las especies de levadura seleccionadas. Los números en los nodos indican los valores de arranque porcentual basados ​​en 1000 repeticiones.

La levadura fermentativa termotolerante común, P. kudriavzevii, está ampliamente distribuida en hábitats naturales. Se ha aislado de varios nichos, como suelo, frutas, aserrín29,47,48, sedimentos de desecho y jugo de caña de azúcar de fábricas de caña de azúcar51, rumen de búfalo31 y alimentos naturalmente fermentados49. También se la conoce como una levadura típica tolerante al estrés múltiple, que incluye estrés térmico, de etanol, furfural, 5-HMF, ácido acético y osmótico31,38,49, y exhibe un alto potencial para producir etanol29,48, proteína unicelular56 y D-xilonato57.

Saccharomycodes ludwigii, una levadura de gemación perteneciente a la familia Saccharomycodeacea, también se conoce como levadura de deterioro en la vinificación debido a su alta tolerancia al dióxido de azufre (SO2)58. Esta levadura no convencional se ha aislado de una variedad de nichos, como vinos dulces59, suelo60, insectos61 y savia de inflorescencia de coco62. Presenta un alto potencial para la producción de biocombustibles y bebidas, especialmente etanol, vino y cerveza de bajo contenido alcohólico63, así como otras producciones químicas, como acetato de etilo48, ácido succínico y glicerol64,65.

Cabe señalar en el estudio actual que la levadura utilizada tradicionalmente para la producción de etanol, Saccharomyces cerevisiae, y la levadura fermentativa termotolerante común, Kluyveromyces marxinus, no se aislaron en investigaciones recientes, lo que podría deberse al efecto sinérgico de temperaturas relativamente altas y estrés por ácido acético. Aunque algunas cepas de S. cerevisiae y K. marxianus pueden soportar altas temperaturas y condiciones de ácido acético, la mayoría son sensibles a los efectos sinérgicos de ambos estreses.

El rendimiento del crecimiento bajo estrés térmico o la capacidad de termotolerancia de las levaduras fermentativas etanológenas seleccionadas se evaluó cultivando las células de levadura en medio YM suplementado con ácido acético glacial 80 mM e incubadas a 30 °C (control), 37 °C, 40 °C , 43 °C y 45 °C durante 48 h. Como se muestra en la Tabla 2, todos los aislados de levadura crecieron bien a 37 °C con una viabilidad celular ligeramente menor que a 30 °C. Curiosamente, S. lugwigii ACP22 mostró una viabilidad celular del 100 %, al igual que el tratamiento de control a 30 °C. Todos los aislados de levadura seleccionados mostraron un buen crecimiento a 40 °C, con una viabilidad celular de 42,15–78,98 % en comparación con un tratamiento de control a 30 °C. Aunque todos los aislados de levadura seleccionados pudieron crecer a 43 °C, sus viabilidades celulares se redujeron notablemente a 5,80–14,80 %, 25,36–36,20 % y 24,46 % para S. ludwigii, P. kudriavzevii y P. manshurica, respectivamente. en comparación con el tratamiento de control. No se observó crecimiento de S. ludwigii a 45 °C, mientras que P. kudriavzevii y P. manshurica exhibieron un bajo nivel de crecimiento a esta temperatura, lo que sugiere que P. kudriavzevii y P. manshurica fueron más resistentes térmicamente que S. ludwigii. Con base en la capacidad de crecimiento de todos los aislados de levadura seleccionados a temperaturas superiores a 40 °C, se consideraron levaduras termotolerantes66.

La capacidad de las células de levadura para utilizar una amplia gama de azúcares, especialmente azúcares fermentables liberados de materiales lignocelulósicos después del proceso de pretratamiento e hidrólisis, es un enfoque prometedor para la producción de bioetanol de segunda generación. En el presente estudio, se determinó la utilización de los principales azúcares de materiales lignocelulósicos, incluyendo glucosa, galactosa, xilosa y arabinosa, y los disacáridos que se encuentran principalmente en los desechos de frutas o procesos lácteos, como maltosa, sacarosa y lactosa, y los resultados se resumen en la Tabla 2. Todos los aislados de levadura seleccionados pueden usar glucosa y sacarosa como fuentes de carbono. Además, un grupo de cepas de P. kudriavzevii (LF56, LF98, LF101, LF119, AC1 y AC4) y una cepa de P. manshurica (LF137) también pueden usar xilosa como fuente de carbono, similar a los estudios informados por Avchar et al. 31 y Aouine et al.49. Sin embargo, no hubo aislados de levadura seleccionados que usaran galactosa, arabinosa, maltosa y lactosa como fuentes de carbono en este estudio. La capacidad de usar galactosa, arabinosa y maltosa como fuentes de carbono se ha informado en las cepas RGB7.2, RGB7.7, RGB8.531, YSR1 y YSR2949 de P. kudriavzevii. En particular, los perfiles de utilización de azúcar de la levadura S. ludwigii recién aislada en este estudio coincidieron con los hallazgos de De Francesco et al.67.

El pretratamiento de biomasas lignocelulósicas libera no solo monómeros de azúcar fermentables sino también otros subproductos conocidos como inhibidores del pretratamiento lignocelulósico. Se sabe que muchos son citotóxicos, lo que provoca efectos graves en el crecimiento microbiano y la actividad de fermentación. La mayoría de estos inhibidores de pretratamiento lignocelulósico incluían ácidos alifáticos, especialmente ácido acético y ácido fórmico, que se originan de la fracción de hemicelulosa y en parte de la degradación de celulosa y lignina, compuestos fenólicos que se derivan de polímeros de lignina y derivados de furano, como furfural y 5 -HMF, que se generan durante las reacciones de deshidratación de los azúcares pentosa y hexosa, respectivamente21,68. Las concentraciones de estos compuestos inhibidores dependen en gran medida de los tipos de materia prima y de los procesos de pretratamiento21. Estos compuestos inhibidores generalmente se eliminan total o parcialmente a través de diferentes procesos de desintoxicación, que son costosos y complicados, como físicos, químicos y biológicos, antes de usarse para la formación de etanol u otros bioproductos69. La aplicación de levaduras etanológenas potenciales que sean tolerantes a los inhibidores lignocelulósicos es una técnica prometedora y rentable para la producción de etanol lignocelulósico.

Anteriormente se informó que el daño inducido por el estrés por calor u otros inhibidores, como el etanol, el ácido acético, el furfural y el 5-HMF, comparten características comunes específicas, por ejemplo, la acumulación de especies reactivas de oxígeno, el daño de la membrana y la desnaturalización. de macromoléculas, que posteriormente desencadenan mecanismos de respuesta al estrés para proteger a las células de levadura de condiciones de estrés severo. Las células de levadura que muestran una alta resistencia al calor también pueden poseer la capacidad de tolerar otras tensiones70. Por lo tanto, todos los aislados de levadura termotolerantes seleccionados se evaluaron en cuanto a su capacidad para soportar el ácido acético, el furfural, el 5-HMF y el etanol utilizando medio YM suplementado con cada inhibidor en diferentes concentraciones. Como se muestra en la Tabla 3, la viabilidad de las células de levadura varió según las cepas de levadura y los tipos de inhibidores. Para el estrés por ácido acético, todas las levaduras seleccionadas, excepto las cepas ACP22, LF101, LF119, LFRE2, RBRE2 y MGRE2, crecieron bien a una concentración de ácido acético de 80 mM, con una viabilidad celular superior al 50 % en comparación con el tratamiento de control. Sin embargo, la viabilidad de las células de levadura disminuyó notablemente cuando la concentración de ácido acético aumentó a 120 mM y 160 mM. Con ácido acético 160 mM, solo diecinueve cepas de levaduras mostraron una supervivencia celular superior al 20% en comparación con el control, y la mayoría de ellas pertenecían a S. ludwigii.

La mayoría de los aislados de levadura seleccionados exhibieron un buen crecimiento bajo estrés por furfural. En la concentración más alta de furfural (15 mM), todos los aislados de levadura, excepto LF56, LF98, LF101, LF119, LF137, RBRE2, APRE1, AC1, AC4 y MGRE2, mostraron tasas de supervivencia celular superiores al 50 % en comparación con el control. . Curiosamente, las cepas RR1, RR2, RR3, LFRE1, LFRE2 y APRE2 de S. ludwigii mostraron una supervivencia celular superior al 70 % a una concentración de furfural de 15 mM en comparación con otros aislados. En cuanto al efecto inhibitorio del 5-HMF a concentraciones de 10-20 mM, la mayoría de los aislados de levadura seleccionados fueron susceptibles a este compuesto, especialmente a una concentración de 20 mM. Veintitrés aislados de levadura mostraron una supervivencia celular superior al 60 % con 5-HMF 10 mM, mientras que sólo quince aislados de levadura mostraron una supervivencia celular superior al 50 % con 5-HMF 15 mM. Sorprendentemente, solo un aislado de levadura, ACP22, exhibió la supervivencia celular más alta de 50,33 % a la concentración más alta de 5-HMF.

Con respecto al estrés por etanol, todos los aislados de levadura seleccionados pueden tolerar concentraciones de etanol en el rango de 4-8% (v/v), aunque su viabilidad celular disminuyó con una mayor concentración de etanol. Se detectó una supervivencia celular superior al 70 %, 60 % y 50 % cuando las células de levadura se cultivaron en medio suplementado con etanol al 4 %, 6 % y 8 % (v/v), respectivamente. Curiosamente, ocho aislados de levadura, ACP21, ACP26, RR1, RR2, RR3, RR4, LFRE1 y LFRE2, mostraron una supervivencia celular superior al 70 % en medio suplementado con etanol al 8 % (v/v).

El efecto inhibidor del ácido acético, el furfural, el 5-HMF y el etanol sobre el crecimiento de células microbianas se ha informado anteriormente. La exposición a ácidos débiles como el ácido acético generalmente afecta el crecimiento celular y altera el metabolismo del carbono. El ácido acético a una concentración baja de 60 mM suprime el crecimiento de S. cerevisiae71. Además, las altas concentraciones de ácido acético impactan negativamente en el transporte de protones transmembrana, lo que afecta la homeostasis del pH, la integridad de los lípidos de la membrana y la estabilidad de las proteínas y, finalmente, provoca la muerte celular71,72. Se sabe que los inhibidores de aldehído, como el furfural y el 5-HMF en una concentración baja (0,5–2,0 g/L), causan daño a las macromoléculas, como los ácidos nucleicos (ADN y ARN), las proteínas y las membranas celulares70,73. Estos inhibidores de aldehído pueden perturbar las actividades metabólicas de las células microbianas ya sea por la reacción directa del grupo funcional aldehído o por inducir la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que puede causar mutación, inactivación de proteínas y enzimas y daño celular74. Con respecto al estrés por etanol, una alta concentración de etanol afecta negativamente el crecimiento celular al inhibir la división y elongación celular, lo que da como resultado una reducción en la tasa de crecimiento específico y la viabilidad celular. Además, altas concentraciones de etanol también provocan la desnaturalización de macromoléculas, como ADN, ARN, proteínas y enzimas, lo que puede conducir a la muerte celular75,76.

Según el efecto inhibidor del ensayo de inhibidor de pretratamiento lignocelulósico, un total de diecinueve aislados de levadura exhibieron una viabilidad celular relativamente alta en todas las condiciones de estrés, es decir, más del 20 % de supervivencia celular con ácido acético 160 mM, más del 50 % con furfural 15 mM. , superior al 35 % con 5-HMF 20 mM y superior al 50 % con etanol al 8 %, y se seleccionaron para estudios adicionales. Estas cepas incluyeron ACP20, ACP21, ACP22, ACP24, ACP26, RR1, RR2, RR3, RR4, LFRE1, LFRE2, SNRM1, SNRM2, RBRE1, DGRE1, DGRE2, APRE2, MGRE1 y OR2, que pertenecen a S. ludwigii. Estos hallazgos sugieren una alta posibilidad de utilizar S. ludwigii para la producción de etanol a alta temperatura en condiciones de estrés utilizando biomasa lignocelulósica como materia prima.

El efecto inhibidor del ácido acético y el furfural, los inhibidores de pretratamiento lignocelulósico más predominantes, sobre la producción de etanol de los aislados de levadura seleccionados se investigó a 37 °C usando medio YM que contenía 160 g/L de glucosa y complementado con ácido acético 80 mM o 15 mM furfural. Los resultados se resumen en la Tabla 4. Las concentraciones de etanol y las productividades de todos los aislados de levadura bajo la condición de control sin inhibidores fueron más altas que las de los tratamientos con ácido acético y furfural. La concentración máxima de etanol y la productividad de 65,45 g/L y 1,36 g/Lh se lograron con el aislado de levadura APRE2. Bajo estrés de ácido acético, las concentraciones de etanol producidas por las levaduras seleccionadas oscilaron entre 37,83 y 65,08 g/L, con una productividad de 0,79 a 1,36 g/Lh Nueve aislados de levadura, es decir, ACP21, ACP26, RR1, LFRE1, LFRE2, RBRE1, DGRE2, APRE2 y MGRE1 presentaron concentraciones de etanol superiores a 50 g/L; entre ellos, el aislado de levadura APRE2 presentó la mayor concentración de etanol con 65,08 g/L, mientras que ACP22 presentó el valor más bajo (37,83 g/L). La eficiencia de producción de etanol de los aislados de levadura seleccionados fue ligeramente menor bajo estrés con furfural que aquellos bajo los tratamientos de control y ácido acético. Los contenidos de etanol bajo estrés con furfural oscilaron entre 26,38 y 47,85 g/L, con una productividad de 0,55 a 1,00 g/Lh. Solo cuatro aislados de levaduras, ACP21, LFRE1, DGRE2 y APRE2, exhibieron títulos de etanol superiores a 40 g/L en condiciones de estrés. esta condición de estrés. El aislado de levadura APRE2 dio la concentración más alta de etanol, mientras que DGRE1 produjo la concentración más baja. Ambas cepas pertenecían a S. ludwigii, pero sus diferencias en el rendimiento de la producción de etanol podrían atribuirse a las diferencias en los antecedentes genéticos.

En general, la capacidad de las levaduras para resistir un alto nivel de contenido de ácido acético y furfural depende de varios factores, como el medio de cultivo, las condiciones de fermentación y la especie de levadura. Por ejemplo, la cepa R32 de S. cerevisiae recombinante podría tolerar ácido acético y furfural en concentraciones de 0,55 % (v/v) y 0,3 % (v/v), respectivamente, a 40 °C77, mientras que la cepa RGB3.2 de P. kudriavzevii aislado del rumen de búfalo pudo resistir 0,4% (v/v) de ácido acético y 1,5 g/L de furfural a la misma temperatura31. Díaz-Nava et al.30 reportaron recientemente que la levadura nativa P. kudriavzevii ITV-S42 aislada de jugo de sorgo dulce podría resistir ácido acético y furfural en concentraciones de hasta 24 g/L y 1 g/L, respectivamente, a 40 °C . En el estudio actual, cuatro aislados de levadura, ACP21, LFRE1, DGRE2 y APRE2, exhibieron títulos de etanol relativamente altos bajo estrés por ácido acético y furfural. Por lo tanto, fueron seleccionados para una evaluación adicional de su fermentación de etanol en condiciones de estrés múltiple a 37 °C.

Uno de los propósitos del presente estudio es emplear levaduras termotolerantes al ácido acético y termoseleccionadas altamente eficientes para la producción de etanol a partir de hidrolizado lignocelulósico tratado con ácido, que podría contener una mezcla de sustancias inhibidoras, especialmente ácido acético y furfural, el inhibidor más predominante. compuestos en el hidrolizado lignocelulósico. Por lo tanto, se determinó la producción de etanol de los aislados de levadura seleccionados en presencia del cóctel de inhibidores. Se utilizó un medio YM que contenía 160 g/L de glucosa y suplementado con un cóctel de inhibidores compuesto por ácido acético 80 mM y furfural 15 mM a diferentes cargas como medio de fermentación para evaluar la eficiencia de producción de etanol de las levaduras seleccionadas. Como se muestra en la Tabla 5, todos los aislados de levadura seleccionados pudieron producir etanol bajo todos los cócteles de inhibidores examinados aquí, lo que indica su tolerancia a las condiciones de estrés múltiple. Las concentraciones y productividades de etanol producidas por las levaduras seleccionadas en el tratamiento control oscilaron entre 53,52 y 55,38 g/L y entre 1,12 y 1,15 g/Lh, respectivamente, mientras que esos valores, cuando se produjeron en presencia de los cócteles de inhibidores, oscilaron entre 57,10 y 1,15 g/Lh. 63,07 g/L y 1,19 a 1,31 g/Lh, respectivamente. El aislado de levadura APRE2 dio la concentración de etanol más alta de 63,07 g/L, con una productividad de 1,31 g/Lh y una eficiencia de rendimiento del 87,60 % en presencia de una carga de cóctel de inhibidor del 50 %, y 60,02 g/L, con una productividad de 1,25 g/Lh y una eficiencia de rendimiento del 81,58 % en el caso de una carga de cóctel de inhibidor del 100 %. Con base en este hallazgo, el aislado de levadura APRE2 exhibió una tolerancia superior a las condiciones de estrés múltiple; por lo tanto, se eligió para la producción de etanol utilizando PWH como materia prima en el siguiente experimento.

Cabe señalar en el estudio actual que los títulos de etanol producidos en presencia de cócteles de inhibidores, especialmente ácido acético, fueron ligeramente superiores a los del tratamiento de control sin inhibidores. Estos hallazgos fueron similares a los de Taherzadeh et al.78 y Thomas et al.79, quienes afirmaron que el ácido acético provocó una reducción en el rendimiento de biomasa junto con un aumento en la producción de etanol. Este fenómeno puede explicarse por el desvío de carbono del crecimiento de biomasa a la producción de etanol para la generación de ATP necesaria para mantener la homeostasis del pH intracelular y la eliminación del exceso de acetato del citoplasma a través de la bomba de salida de ácido débil dependiente de energía80,81.

La piña es un cultivo económico con una producción global de aproximadamente 24,79 millones de toneladas métricas anuales. Tailandia es uno de los principales países en producción de piña, con 2,21 millones de toneladas métricas, lo que representa el 8,91 % de la producción mundial82. Durante el proceso de producción de la piña, aproximadamente el 50 % (p/p) del peso de la piña se desecha como desecho, incluida la cáscara, el corazón, el tallo y las hojas de la piña83. Entre estos, la cáscara y el corazón de la piña son materias primas prometedoras para la producción de bioetanol de segunda generación, ya que son altamente biodegradables y ricas en proteínas y carbohidratos84. Estos desechos de piña contienen una alta cantidad de celulosa (16,57%) y hemicelulosa (28,81%) con un bajo nivel de lignina (3,04% de la materia seca total)32. Este estudio evaluó la producción de etanol a partir de PWH pretratada con ácido por la levadura seleccionada S. ludwigii APRE2. Después de un pretratamiento con ácido diluido utilizando H2SO4 al 0,5% (v/v), se detectaron aproximadamente 106 g/L de azúcares totales en el PWH, que fue marcadamente más alto que el encontrado en el hidrolizado de bagazo de caña de azúcar (85 g/L)29 y arroz. hidrolizado de paja (34,5 g/L)31. La glucosa y la fructosa fueron los azúcares más predominantes detectados en el PWH, con 43,89 y 41,64 g/L, respectivamente, seguidos de xilosa y arabinosa, con concentraciones de 5,68 y 4,45 g/L, respectivamente (Figura complementaria S1). Otros azúcares en la piña, como la sacarosa, no se detectaron en el PWH. Este hallazgo puede explicarse por el hecho de que la sacarosa se convierte en glucosa y fructosa durante el pretratamiento con ácido diluido, similar a lo informado por Phong et al.32.

Además de los azúcares fermentables, un pretratamiento con ácido diluido de los desechos de piña utilizando H2SO4 al 0,5 % (v/v) también liberó los inhibidores del pretratamiento lignocelulósico, incluidos el ácido acético y el furfural. No se detectaron 5-HMF ni compuestos fenólicos en el hidrolizado. Las concentraciones de ácido acético y furfural en el PWH fueron de 131 mM y 3,95 mM, respectivamente, comparables a las reportadas por Phong et al.32. Cuando se utilizó directamente PWH como materia prima para la producción de etanol a 37 °C utilizando S. ludwigii APRE2, se logró una concentración máxima de etanol de 38,02 g/L, una productividad de 1,58 g/Lh y un rendimiento de etanol del 82,35 % (Fig. . 2), lo que sugiere que el crecimiento y la actividad de fermentación de etanol de S. ludwigii APRE2 no se vieron afectados por el ácido acético y el furfural en la materia prima. La eficiencia de producción de etanol de S. ludwigii APRE2 se comparó con otras levaduras etanológenas utilizando diferentes materias primas y los resultados se resumen en la Tabla 6. La concentración de etanol producida por S. ludwigii APRE2 fue comparable a la producida por S. cerevisiae utilizando residuos de cáscara de pomelo85 , S. cerevisiae TISTR 5048 utilizando residuos de cáscara de piña86, P. kudriavzevii RZ8-1 utilizando bagazo de caña de azúcar29 y S. cerevisiae HG1.1 utilizando residuos de piña32 como materia prima. Por el contrario, la concentración de etanol y la productividad logradas con S. ludwigii APRE2 fueron aproximadamente de 4,1 a 4,7 veces más altas que las de P. kudriavzevii RGB3.2 y K. marxianus RGB4.5, respectivamente, utilizando hidrolizado de paja de arroz como materia prima31. Las diferencias en el título de etanol pueden correlacionarse con la concentración inicial de azúcar en la materia prima. El hidrolizado de paja de arroz contenía 19,10 g/L de azúcar total, mientras que el PWH utilizado en este estudio poseía 106 g/L, que era 5,5 veces mayor que el del hidrolizado de paja de arroz.

Perfil temporal de la producción de etanol a partir de hidrolizado de desecho de piña utilizando S. ludwigii APRE2 a 37 °C.

Aunque la levadura S. ludwigii APRE2 recién aislada podría producir una alta concentración y rendimiento de etanol utilizando biomasa lignocelulósica como materia prima, no fermenta la xilosa y la arabinosa en etanol (Fig. 2). Se necesitan más estudios para mejorar la eficiencia de producción de etanol; por ejemplo, explorar el potencial de una estrategia de fermentación en dos etapas o mejorar la capacidad de las levaduras para crecer y fermentar azúcares de pentosa mediante evolución de laboratorio adaptativa o estrategias de ingeniería genética. Además, se podrían emplear otras cepas de levadura para convertir la xilosa en xilitol87,88.

En este estudio, aislamos con éxito veintinueve levaduras fermentativas tolerantes al ácido termo y acético de frutas ácidas tropicales, que comprenden tres especies principales de levadura, a saber, S. ludwigii, P. kudriavzevii y P. manshurica. De estos, S. ludwigii APRE2 fue la levadura termotolerante al ácido acético y termo más efectiva para la fermentación de etanol a alta temperatura. Mostró un buen crecimiento a temperaturas de hasta 43 °C y pudo soportar condiciones de estrés múltiple, incluido ácido acético, furfural, 5-HMF y etanol en concentraciones de hasta 160 mM, 15 mM, 20 mM y 8 % (v/v) , respectivamente. La levadura recién aislada, S. ludwigii APRE2, produjo una concentración máxima de etanol de 63,07 g/L y tuvo una productividad de 1,31 g/Lh en medio YM que contenía 160 g/L de glucosa suplementado con un cóctel inhibidor que comprendía ácido acético 80 mM y 15 furfural mM. También mostró una alta eficiencia de fermentación de etanol utilizando PWH que contenía ácido acético 131 mM y furfural 3,95 mM como materia prima, con una concentración máxima de etanol y una productividad de 38,02 g/L y 1,58 g/Lh, respectivamente. Con una mayor optimización de los parámetros de fermentación, S. ludwigii APRE2 puede utilizarse potencialmente para la producción de bioetanol lignocelulósico a alta temperatura.

El envío de un artículo implica que el trabajo descrito no ha sido publicado previamente en ninguna forma.

Los conjuntos de datos de secuencias de ADN generados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio de NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), con el número de acceso de GenBank que se muestra en la Tabla 1.

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Los autores desean agradecer a la Facultad de Tecnología de la Universidad de Khon Kaen por otorgar una beca a WP. También agradecemos a las Universidades Nacionales de Investigación (NRU) (número de concesión BiF-2553-Ph.d-01) y a la Investigación y Estudios de Posgrado de la Universidad de Khon Kaen, a través del Programa de Investigación titulado "Integración para la producción de bioenergía y biocompuestos valiosos a partir de desechos agrícolas", por el apoyo financiero.

Esta investigación fue apoyada financieramente por las Universidades Nacionales de Investigación (NRU) (número de subvención BiF-2553-Ph.d-01) y la Investigación y Estudios de Posgrado de la Universidad de Khon Kaen, a través del Programa de Investigación titulado "Integración para bioenergía y valiosa bio- producción de compuestos a partir de desechos agrícolas".

Departamento de Biotecnología, Facultad de Tecnología, Universidad de Khon Kaen, Khon Kaen, 40002, Tailandia

Warayutt Pilap, Preekamol Klanrit y Pornthap Thanonkeo

Instituto de Investigación Botánica Walai Rukhavej, Universidad de Mahasarakham, Mahasarakham, 44150, Tailandia

Sudarat Thanonkeo

Centro de Investigación de Fermentación para Productos Agrícolas de Valor Agregado (FerVAAPs), Universidad de Khon Kaen, Khon Kaen, 40002, Tailandia

Preekamol Klanrit y Pornthap Thanonkeo

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WP realizó los experimentos y analizó los datos. ST concibió las ideas y analizó los datos. PK y PT concibieron las ideas, diseñaron los experimentos, analizaron los datos, prepararon, revisaron y presentaron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Pornthap Thanonkeo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Pilap, W., Thanonkeo, S., Klanrit, P. et al. El potencial de la levadura tolerante al estrés múltiple, Saccharomycodes ludwigii, para la producción de bioetanol de segunda generación. Informe científico 12, 22062 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26686-x

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Recibido: 17 Octubre 2022

Aceptado: 19 de diciembre de 2022

Publicado: 21 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26686-x

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